开口箭皂苷体外抗肿瘤作用初步实验探究.doc

开口箭皂苷体外抗肿瘤作用初步实验探究 　 作者：杨春艳，刘朝奇，邹坤，汪鋆植，周永芹，刘小琴 【摘要】 　　目的通过体外细胞培养技术，探讨开口箭皂苷的细胞毒活性及其机制，为进行深层次研究提供依据。方法MTT比色法检测细胞活力，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果MTT结果显示，开口箭总皂苷、30%皂苷和70%皂苷对Hela和HepG2细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相比有非常显著性差异（Plt;0.005）。开口箭总皂苷、30%皂苷和70%皂苷和环磷酰胺对Hela细胞IC50分别为1 372.92，3 138.51，729.72，3 459.08 μg/ml；对HepG2细胞IC50分别为1 221.39，2 657.53，562.70，3 668.51μg/ml。流式细胞仪检测结果显示，开口箭总皂苷、30%总皂苷在浓度为2 500μg/ml时，70%总皂苷和环磷酰胺在浓度为1 250 μg/ml时主要将Hela细胞细胞周期阻滞于S期，且能够诱导肿瘤细胞凋亡。结论开口箭皂苷对Hela和HepG2细胞较环磷酰胺具有明显的抑制作用，其中对HepG2细胞株较为敏感，且能将Hela细胞细胞周期阻滞于S期从而诱导Hela细胞凋亡。 【关键词】 开口箭； 皂苷； MTT法； 流式细胞仪 　　开口箭Tupistra chinensis Bak.系百合科Liliaceae铃兰族开口箭属植物，为著名的传统中药。医学古籍记载，开口箭味甘微苦，性寒，主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛、月经不调、崩漏带下等症；其中中医认为月经不调、崩漏带下即是现代宫颈癌的常见症状。初步实验表明开口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用［1，2］。 　　本实验室通过实验显示湖北省产开口箭含有甾体皂苷和甾体皂苷元,且含量较高［3］。有关研究结果表明，皂苷具有增强免疫功能、抗辐射、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物学活性,近年越来越受人们的普遍关注。有研究证实开口箭同属植物皂苷成分有细胞毒活性［4，5］。本文旨在通过体外抗肿瘤实验,观察开口箭皂苷对宫颈癌细胞Hela细胞和肝癌细胞HepG2细胞的细胞毒活性,并通过流式细胞仪评价开口箭活性部位对Hela细胞细胞周期的影响和诱导该肿瘤细胞凋亡情况。现报道如下。 　　1 材料与仪器 　　1.1 细胞株人宫颈癌细胞（Hela）、人肝癌细胞(HepG2)均由三峡大学分子生物学研究所提供。 　　1.2 药品与仪器RPMI-1640为美国GIBCO公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品；HEPES为美国Sigma公司产品；胰蛋白酶为美国GIBCO公司产品；四氮唑蓝(MTT)为美国AMRESCO公司产品；环磷酰胺 (CP,江苏恒瑞医药股份有限公司，批号。酶联免疫检测仪(GENIOS TECAN)；CO2培养箱（日本三洋公司）；LD4-2A离心机(北京医用离心机厂)；96孔板(美国Cornning公司)。 　　开口箭根茎于2002-07采自湖北省神农架林区，经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为Tupistra chinensis Bak.，标本存放于湖北省天然产物研究与利用重点实验室（No.TC200207SNJ）。 　　2 方法 　　2.1 药物制备开口箭根茎粉碎后，用甲醇回流提取，合并提取液，浓缩后经氯仿脱脂后用水饱和的正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇，浓缩液抽干后即得到开口箭总皂苷，配成水液，过大孔树脂柱，水洗， 30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，得开口箭4部分皂苷。 　　分别取开口箭总皂苷、30%开口箭皂苷、70%开口箭皂苷两个样品，用PBS配制成所需浓度，依次为312.5，625，1 250，2 500，5 000，10 000 μg/ml， 70%开口箭皂苷用PBS配制成所需浓度，依次为156.25，312.5，625，1 250，2 500，5 000 μg/ml，所有受试样品均用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。环磷酰胺 (CP)用DMSO将其配置为500 mg/ml。 　　2.2 细胞培养 Hela和HepG2细胞用RPMI-1640培养液（另加10mmol/L HEPES、2.0 mg/mlNaHCO3、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10%新生小牛血清），于CO2孵箱中37℃，5%CO2饱和湿度下培养。贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。 　　2.3 开口箭活性部位对Hela和HepG2细胞杀伤作用最佳实验条件的选择MTT法实验条件的初步优化，主要是对溶解药物的溶剂（水、PBS）、加药前的培养时间（6，12，24 h）、药物剂量和细胞密度进行了摸索。其中密度细胞分别取0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105个/ml,接种