单链可变区片段及趋化因子融合独特型淋巴瘤疫苗原核表达质粒.docVIP

单链可变区片段及趋化因子融合独特型淋巴瘤疫苗原核表达质粒 　 作者：王福旭　赵冰　程云会　潘崚　罗建民　张学军　董作仁 【摘要】 　　本研究目的在于克隆小鼠 B 细胞淋巴瘤细胞膜免疫球蛋白（Ig）的单链可变区片段（scFv），与单核细胞趋化因子（MCP-3）的基因融合，构建融合基因scFv- MCP-3的表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，制备作为治疗B细胞淋巴瘤的独特型融合蛋白疫苗。采用RT-PCR法扩增BALB/c小鼠源B细胞淋巴瘤A20细胞株的Ig VH和Ig VL基因，重组PCR法用一段编码 (Gly4Ser)3连接肽的基因序列连接两基因，制备scFv片段。用相同PCR方法，选用一段编码NDAQAPKS连接肽的基因序列，连接scFv与MCP-3基因，获得scFv- MCP-3融合基因片段。定向克隆到原核表达质粒pGLo中，并在大肠杆菌中表达融合蛋白。测序结果表明：分别成功克隆A20细胞的Ig VH 和Ig VL基因，并成功制备了scFv片段和scFv- MCP-3融合基因片段；限制性酶切方法证实，重组pGLo/scFv- MCP-3原核表达质粒中融合基因准确插入。SDS电泳分析显示，融合蛋白分子量约65 kD, 与预期蛋白分子量一致，并且目的蛋白占菌体蛋白的30%。 结论：本研究成功构建鼠源scFv片段与趋化因子MCP-3融合的独特型B细胞淋巴瘤疫苗表达质粒pGLo/scFv- MCP-3，并实现融合蛋白的初步表达。 【关键词】 本研究目的在于克隆小鼠 B 细胞淋巴瘤细胞膜免疫球蛋白（Ig）的单链可变区片段（scFv），与单核细胞趋化因子（MCP-3）的基因融合，构建融合基因scFv- MCP-3的表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，制备作为治疗B细胞淋巴瘤的独特型融合蛋白疫苗。采用RT-PCR法扩增BALB/c小鼠源B细胞淋巴瘤A20细胞株的Ig VH和Ig VL基因，重组PCR法用一段编码 (Gly4Ser)3连接肽的基因序列连接两基因，制备scFv片段。用相同PCR方法，选用一段编码NDAQAPKS连接肽的基因序列，连接scFv与MCP-3基因，获得scFv- MCP-3融合基因片段。定向克隆到原核表达质粒pGL 　　Construction and Expression of A Prokaryotic Expression Plasmid of Idiotypic Vaccine against B Cell Lymphoma： Encoding the Fusion Genes of Single-Chain Variable Fragment and MCP-3 　　　Department of Hematology, The Second Hospital; 1Department of molecular biology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China AbstractThe aim was to construct a prokaryotic expression plasmid encoding the fusion gene of single-chain variable fragment and monocyte chemotactic protein-3 (MCP-3). The cDNAs of immunoglobulin (Ig) VH and Ig VL were amplified by RT-PCR and assembled into the single-chain variable fragment（scFv） by recombinant PCR method. The cDNAs of Ig VH and Ig VL were connected by a (Gly4Ser) 3 linker. Then, the fragments of scFv and MCP-3 were connected with a NDAQAPKS spacer, using recombinant PCR method again. The results indicated that the fusion gene of scFv-MCP-3 were constructed correctly and cloned into the prokaryotic expression plasmid successfully identified by sequencing and restriction endonucleases examination. Finally, the fusion prote