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南药高良姜基因组DNA提取方法探究 　 作者：庞启华，严萍，赵翾，赵树进 【摘要】 　　目的提取高质量的高良姜基因组DNA，用于药材分子鉴定、分子系统分类和分子进化等下游分子生物学研究。方法在CTAB改良法基础上，采用4个方案提取DNA。结果用改良CTAB法方案4提取的基因组DNA 的OD260/OD280比值在1.8～2.0之间，产率为0.54～1.049 μg/ mg干燥叶片。基因组DNA能被限制性内切酶EcoRⅠ和Mse Ⅰ完全酶切，经AFLP分析，得到了条带清晰的DNA指纹图谱。结论 用改良CTAB法方案4提取的基因组DNA纯度高，符合分子生物学研究要求。 【关键词】 高良姜； 基因组DNA； 提取 　　Abstract:ObjectiveTo develop a method to prepare high quality genomic DNA of A. officinarum Hance for downstream molecubiological research. MethodsFour protocols based on modified CTAB method was performed to extract genomic DNA from A. officinarum Hance. ResultsThe OD260/OD280 ratios of genomic DNA extracted with the fourth protocol of modified CTAB method ranged from 1.8 to 2.0, the yields of DNA sample were in the range of 0.54～1.049 μg/mg dried leaf tissue. DNA samples were completely digested with restriction enzymes ( EcoRⅠ and Mse Ⅰ) and were successfully used for AFLP. ConclusionThe DNA samples extracted with the fourth protocol of modified CTAB method are with high quality and suitable for molecubiological research. 　　Key words:Alpinia officinarum Hance; Genomic DNA; Extraction 　　高良姜Alpinia officinarum Hance是姜科山姜属植物，在中国主要分布于广东、海南、台湾、云南和广西(后两省为引种)。高良姜干燥的根茎是著名的十大南药之一，有一千多年药用历史，据《中国药典》记载，高良姜味辛、性热，归脾、胃经，具有温胃散寒、行气止痛和消食的功效［1］，研究表明高良姜还有广泛的药理作用［2］，在香料生产和水果保鲜上也有应用 ［3，4］。长期的采挖和生态环境破坏，导致高良姜野生资源骤减，目前主要通过无性繁殖的方式进行人工栽培。近年来，国际市场对高良姜需求增大，国产高良姜远销中东和欧美，价格呈上升趋势，利益的驱动导致了混淆品和伪品的出现，影响了治疗效果，扰乱了市场，对高良姜的出口造成了负面影响。通过DNA分子标记技术建立高良姜的DNA指纹图谱，以及进行高良姜的分子系统分类、分子进化和遗传多样性研究，可以为高良姜的药材的分子鉴定和质量控制，以及高良姜种质资源保护和开发提供科学依据，而提取高质量的高良姜基因组DNA是进行下一步研究的前提条件。 植物含有丰富的次生代谢物，这些化合物的存在干扰了基因组DNA的提取，不同的植物含有的次生代谢物不一样，基因组DNA的提取方法有所不同，主要有CTAB法和SDS法两种基本方法，并在此基础上进行改良以适合不同的植物［5～7］。本研究根据常规的CTAB法［8］进行改良，比较了4个方案提取高良姜基因组DNA的效果，其中，方案4提取效果较好，DNA纯度和产率较高，可以用于下游的分子生物学研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂和溶液CTAB，PVP-40，Tris为Genview分装，β-巯基乙醇、RNAse A为sigma分装，EDTA、氯仿、异戊醇、异丙醇和无水乙醇为国产分析纯，EcoRⅠ和Mse Ⅰ为NEB产品，λHind Ⅲ marker和DL2000 marker为Takara产品。 清洗缓冲液： 200 mmol/LTris-HCl (pH8.0)；50 mmol/L EDTA；250 mmol/L NaCl；2%PVP-40(W/V) 提取缓冲液A： 2%CTAB