兔抗人细胞色素P450 4A11合成肽抗体制备及鉴定.docVIP

兔抗人细胞色素P450 4A11合成肽抗体制备及鉴定 　 ; 作者：杨微, 刘海英, 武正华, 唐晓波, 朱大岭 毕业论文 【关键词】; CYP4A11;,合成肽;,多克隆抗体 毕业论文 　　[摘 要]; 目的: 制备兔抗人细胞色素P450 4A11 （CYP4A11）抗体, 并对其特性进行初步鉴定。方法: 利用生物信息学方法分析CYP4A11蛋白的序列, 根据亲水性结构、 柔韧区、 抗原指数及表面概率结构等指标选择多肽序列、 合成CYP4A11多肽, 与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联, 免疫大耳白兔制备抗CYP4A11抗体。辛酸硫酸铵法纯化抗体, 对纯化的抗体进行ELISA、 Western blot、 免疫组化等鉴定。结果: 获得抗CYP4A11合成肽的抗体。该抗体效价为1∶32000。可与CYP4A11合成肽及天然CYP4A11出现特异性反应, 该抗体识别的相应抗原的相对分子质量（Mr）为53000, 可识别正常肝脏的CYP4A11。结论: 合成的多肽KLH复合物具有免疫原性, 可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP4A11合成肽抗体可应用于ELISA、 Western blot、 免疫组化等实验。 毕业论文 　　[关键词]CYP4A11; 合成肽; 多克隆抗体 毕业论文 　　人细胞色素P450 4A11是细胞色素P450 4A亚型之一, 主要分布在肝脏和肾脏, 其可以催化多种脂肪酸（月桂酸等）的代谢, 调节体内脂类代谢平衡[1]。CYP4A11催化内源性花生四烯酸代谢生成20羟基廿碳四烯酸（20H ydroxyeicosatetraenoicacid, 20HETE）, 而20HETE与原发性高血压形成有关[2]。CYP4A11还参与防御紫外线氧化损伤的机制[3]。目前对CYP4A11的研究正逐渐深入。国外已研究出重组CYP4A11抗体, 而国内尚无这方面报道。因此, 我们制备CYP4A11的抗体, 这将对CYP4A11的生理功能、 组织定位以及与某些疾病的关系研究起重要的推动作用。 毕业论文 　　1; 材料和方法 毕业论文 　　1.1; 材料; 雄性大耳白兔6周龄, 由哈尔滨医科大学动物实验中心提供。福氏佐剂及3,3,5,5四甲基联苯胺（TMB）均购自Sigma公司。HRP山羊抗兔IgG购自Jackson Immuno Research公司。牛血清白蛋白（BSA）购自Solarbio公司。硝酸纤维素膜（NC）购自BIORAD公司。ECL Plus购自Amersham Biosciences公司。即用型SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。多肽合成及其与KLH、 BSA的联接由北京中科亚光生物科技有限公司完成。正常人肝脏组织, 由“人类肝脏蛋白质组计划”项目提供。 毕业论文 　　1.2; 方法 　　 　　1.2.1; CYP4A11合成肽的设计; 利用DNAStar软件根据抗原指数(Antigenic Index)、 亲水性结构（Hydrophilicity Plot）、 柔韧区(Flexible Regions)及表面概率结构(Surface Probability; Plot)4个参数综合分析CYP4A11序列的特点, 确定505～519位15个氨基酸为欲合成的肽序列: RLRRLPNPCEDKDQL。 毕业论文 　　1.2.2; CYP4A11肽的合成及其与KLH和BSA的交联; CYP4A11合成肽由北京中科亚光生物科技有限公司采用合成肽自动合成仪合成; 获得的合成肽经常规C18的RPHPLC柱进行纯化, 纯度为96.9%。CYP4A11与KLH和BSA的交联采用戊二醛连接法, 将5 mg合成肽分别加入7 mg KLH和BSA中, 边振荡边缓慢加入新鲜配制的3 g/L的戊二醛溶液（1 mL）, 室温作用2 h。以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜, 交联形成CYP4A11KLH、 CYP4A11BSA偶联物。 毕业论文 　　1.2.3; 兔抗CYP4A11合成肽抗体的制备; 取200 μg合成肽KLH偶联物与等量的完全福氏佐剂充分乳化后, 于兔背部皮下多点注射, 每点约100 μg。2 周后加强免疫, 剂量同前, 用不完全福氏佐剂充分乳化后, 于兔背部皮下多点注射; 以后隔2周加强免疫1次; 从第3次加强免疫开始, 每次免疫后7 d, 经耳中央动脉采血测定抗体的效价, 经过4次加强免疫后符合要求时, 立即颈动脉采血, 分离血清后, 无菌分装保存于-80℃备用。 毕业论文 　　1.2.4; 人肝脏微粒体蛋白制备; 取正常人的肝脏、 剪碎, 用磷酸钾盐缓冲液反复冲洗除去血红蛋白后, 加入上述磷酸钾盐缓冲液制成肝匀浆。采用差速