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克拉维酸发酵过程变温控制探究 　 作者：朱校适 冯涛 王永红， 黎亮 张嗣良 刘新山 曹斌 【摘要】 本文在50L自动控制发酵罐上进行了克拉维酸发酵过程温度控制优化试验。分别将发酵过程全程温度控制在24℃、26℃、28℃下进行发酵时，通过对发酵各阶段的重要参数的对比分析，发现温度对棒状链霉菌的生长和代谢有重要影响，降低对数生长期发酵温度可明显缓解前期供氧不足的矛盾。进而通过对发酵过程的变温控制，使克拉维酸的产量由原来3950mg/L提高到4500mg/L，增产11.5%。 【关键词】 克拉维酸； 发酵； 变温控制； 溶氧 ABSTRACT The present work reported optimization of temperaturecontrol strategy in the process of clavulanic acid fermentation on 50Lfermentor. Fermentations run under isothermal way in full processes at 24℃, 26℃ and 28℃ respectively. The profound parameters involved in metabolism were compared and analyzed by different phases. It was found that the temperature greatly affected the growth and metabolism of Streptomyces clavuligerus; lower temperature evidently increased the dissolved oxygen level at the idiophase. Finally a new temperaturecontrol strategy was adopted and clavulanic acid production increased by 11.5%. KEY WORDS Clavulanic acid; Fermentation; Temperaturecontrol; DO 　 克拉维酸(clavulanic acid，CA)是一种β内酰胺酶抑制剂，本身抗菌活性很弱。但当CA与β内酰胺类抗生素制成复方后可以增强β内酰胺类抗生素的抗菌活性和增大其抗菌谱，有助于克服β内酰胺类抗生素耐药性。 CA是由棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的一种次级代谢产物。在研究中我们发现CA发酵在进入对数生长期后溶氧易于跌零，影响CA生物合成。据文献报道温度对棒状链霉菌生长和CA合成都有影响［1～3］。本文以工业生产菌种为对象，考察温度对CA发酵的影响并研究如何通过变温控制提高CA的发酵水平。 1 材料与方法 1.1 菌种 棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus) F21，由山西威奇达制药厂提供。 1.2 试剂 硫酸氢四丁基胺、 NaH2PO4·2H2O、 乙腈(色谱级)、NaOH、CA标准品。 1.3 培养基 (1)种子培养基主要成分为甘油、豆粉、糊精；pH8.0，121℃灭菌30min。 (2)发酵培养基主要成分为甘油、豆粉、糊精、吗丙酸、FeCl3、ZnCl2、MgSO4、MnSO4、CuSO4、CaCl2、FeSO4，pH7.0，121℃灭菌25min。 1.4 培养 (1)种子培养 在无菌的条件下，向装量为600ml/3000ml三角瓶中接入3.5ml孢子液。在25℃，230r/min条件下摇床培养72h，然后转入二级种子罐培养48h。 (2)发酵培养 在无菌条件下，从种子罐取1L种子液接入装量为35L发酵液的50L罐中进行培养。采取分批补料工艺，从20h左右开始补加甘油，用20%氨水自动调控pH在7.0±0.05范围之内。以溶氧30%作为最低限制性溶氧值，每间隔8h取样进行离线参数测量，包括pH、菌浓、黏度等参数并涂片观察菌丝状态；从31h开始进行效价测量。发酵最后阶段每4h取样一次。当大比例的菌丝开始自溶、溶氧回升、效价停滞时放罐。 1.5 测定方法 (1)菌体浓度的测定 采用菌丝占溶液体积的百分比表示。取10ml发酵液反复的离心(3500r/min，10min)和洗涤，直到离心后的固含物中不含有杂质为止，记下菌丝的体积百分比作为菌体浓度；发酵液第一次离心得到的上清液留用。 (2)尾气分析 采用生物尾气分析仪(PS6000型，购自重庆哈特曼测量仪器有限公司)对二氧化碳释放速率(CER)和摄氧率(OUR)，呼吸商(RQ)进行数据采集。