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Gene detection,cloning and transformation 目的基因 可克隆的优良性状的相关基因 主要是结构基因 DNA克隆 DNA cloning Subcloning Host and vector DNA libraries Screening libraries Analysis of clones Application of clone 结构基因组成 转录启动子、基因编码区、转录终止子。 启动子：DNA上RNA聚合酶识别、结合和促使转录的一段核苷酸序列。 转录起始位点：转录mRNA的第一个碱基，多数是A，以此作为序列的＋1，其上游核苷酸序列为“一”，下游核苷酸序列为“＋”。 基因编码区：包括起译码ATG、开读框和休止码TAA（TAG、TGA）。 终止子：提供转录停止信息的核苷酸序列。 原核生物结构基因组成 多数以操纵子形式存在，同类功能的多个基因聚在一起，处于同一个启动子调控之下，下游同具一个终止子，但各基因分别有起译码ATG和休止码TAA（TAG、TGA）。 两个基因之间存在长度不等的间隔序列，但有例外。 启动子含－35序列保守区5’TTGACA3’，－10序列保守区5’ TATAAT3’。 操纵子除启动子外，往往有一些调控转录的其他因子。 在起译码上游约10bp处，有一SD保守区，一般为AGGA。　 转录终止之前常有一段回文序列结构－终止子。 真核生物结构基因组成 基因单独存在，两个基因之间有很长的间隔序列区。内含子、外显子。 转录启动子有3个保守序列区： 　－20--－30：TATA框，DNA在此处开始解链； －70：CAAT框，RNA聚合酶结合。 更上游：GC框，转录调控因子结合。 休止码下游有一保守的AATAAA提供转录产物的释放信号。 不具SD序列区，核糖体与转录的mRNA结合靠mRNA5’端添加的“帽”结构。 分离目的基因 通过构建cDNA文库和基因组文库 产生的cDNA只含编码序列，进行表达还须外加启动子、终止子等调控转录元件。 由于mRNA在不同组织、不同发育时期的细胞内丰度不同，必须用高丰度的mRNA来构建cDNA文库。 用PCR 技术 　 克隆子的筛选 利用抗菌素抗性基因等标记 抗性基因、X-gal和IPTG蓝白斑 双酶切片段重组法 报告基因（GUS、LUC、NPT-II 、CAT） 克隆子的鉴定 酶切 分子 杂交：斑点、Southern杂交 PCR DNA测序 转录产物检测 翻译产物检测 植物细胞转化 Ti转化法 叶盘转化法、原生质体共培养法、悬浮细胞共培养法 直接转移法 电穿孔、微弹轰击法、激光微束穿孔法、多聚物介导法、花粉管通道法、显微注射法、脂质体介导法。 动物细胞转化 病毒颗粒转导法 磷酸钙转染法 DEAE-葡聚糖转染法 DMSO（二甲基亚砜）转染法 脂质体介导法 显微注射 基因打靶 电穿孔 transformation for mamalial animals 磷酸钙沉淀法:Ca2+促进 哺乳动物细胞吸收 外源DNA b.共转化：将过量的媒介DNA与带有tk基因的 重组DNA 混合，用Ca2+沉淀转化细胞。 c. 微量注射：一台仪器每小时注射500-1000个细胞，约50%的细胞能稳定地整合并表达，任何DNA都可注射到任何细胞中，效率高，不需筛选压力，但需要昂贵的仪器，技术复杂，难以掌握。 转化率 每毫克转化的质粒DNA所产生的具抗生素抗性的克隆数 转化子的增殖与保存 单克隆，接种含选择标记抗生素的液体培养基中，部分菌液冻存于甘油保存液中。 克隆技术的应用 重组蛋白 GMO DNA指纹分析 医学诊断 基因治疗 * Gene cloning ①DNA flagments a.chromosal DNA from animal, plants and microbes； b.cDNA from mRNA reverse transcripted in vitro c.chemical synthersized DNA ②insert foreigh DNA into plasmid ③transformation ④selection and identification ⑤expression analysis 原核生物的人工转化 对于体外连接的重组DNA分子，必须采取特殊的保护措施，否则在几小时内就会全部降解。因此在连接后，应尽快引入受体细胞。许多细菌不具有自然转化的能力，需要通过人工诱导才能出现感受态。 competence 自然界中不是所有