ELISA技术的质量控制-医学实验室与临床.docVIP

ELISA技术的质量控制 彭静 孙自镛 Engvall和Perlmann于1971年首先建立了酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）。随着科技的发展，ELISA在抗原、抗体、酶、固相载体及包被技术等方面都有较大的进步，其灵敏度和特异性均大大提高。由于该技术具有简便、快速、经济等特点，因而已被广泛应用于各行业。尽管如此，ELISA在应用过程中仍然存在着许多难点，必须严格控制才能保证检测的质量。 ELISA质量保证是一个复杂的过程，许多环节都影响到检测的质量。现分述如下： 1方法学的影响 ELISA测定模式包括以下几种：双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM抗体捕捉法、竞争抑制法，其中竞争抑制法因受操作时差所引起的不公平竞争等因素的影响，结果重复性较差，质量较难控制。 2试剂因素 2.1试剂的选择 免疫检测的原理均基于抗原抗体反应。由于影响该反应过程的因素较多，如普遍存在基质效应、交叉反应等，因而检测结果难以溯源，不同方法、不同试剂之间甚至同一试剂不同批号间结果均缺乏可比性。试剂质量在很大程度上决定了检测的水平，因此在引入新项目之前必须对试剂进行严格的评估。试剂的评估有以下几个步骤：⑴确定开展该项目的必要性；⑵了解该项目现有的检测方法和原理；⑶在了解试剂的组成基础上选择多家试剂盒进行比较，判断标准首选参考方法或参考物质，其次为临床的满意度及权威机构的报告如各级室间质量评价、CDC报告等；⑷定期对检测结果进行追踪反馈直至最终认可该试剂。 2.2试剂的准备 不同批次的ELISA试剂在制作过程中很难保证质量完全一致，即使是通过批批检的项目其检测结果也存在差异，订购长批号的试剂，并保证保存条件既可保证结果的重复性又可避免因试剂批号改变而重新建立质控体系及重新评估试剂的复杂过程；对于效期短、使用率低的试剂，应当小量分装，避免反复冻融造成试剂的失效。 试剂使用前必须平衡至室温，否则会影响检测下限。未用完的室内质控品及本次不需 作者单位：430030，华中科技大学同济医学院附属同济医院 用的应及时放回冰箱保存。菌体中可能含有内源使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装存。蛋白质局部浓缩，分布不均，每次加标本更换吸嘴，以免发生交叉污染。时避免加在孔壁上部 ，并注意不溅出气泡。加酶结合物和底物时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。在 ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温 育(incubation)温育常采用的温度有 4337℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的温育温度，也是大多数抗原抗体结合的最适反应温度。有实验表明，抗原抗体反应一般在37经12小时产物的生成可达顶峰。为加速反应提高反应的温度。抗原抗体反应4℃环境中更为彻底，但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。的方式ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒预温至规定的温度，。采用水浴，将ELISA板置于水浴箱中，板底贴着水面为避免蒸发，板上应加盖用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。温育，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。温育，显色是 ELISA中的最后一步温育反应，底物显色一般室温或37反应30分钟37℃反应30分钟TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止各类酸性终止液则蓝色转变成黄色为保证实验结果的稳定性，宜在。容器上的划痕指印等造成的光干扰比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体15～30分钟。 8%～5%）；不同试剂盒CO值存在差异；病毒感染存在窗口期；病毒变异后表达产物含量降低以及个体差异等，因此在CO值附近存在一个临床意义可疑的的区域被称之为“灰区”，在国内的传染性病原体抗原和抗体检测的ELISA试剂盒中均未涉及“灰区”的设置，仅仅依靠CO值来决定感染的有无，尤其是对献血员的筛查具有较大的风险，因此对于检测结果位于“灰区”的病人可采用确认实验或追踪检测的办法加以确诊。 ?? 目前“灰区的设置有种：⑴CO×（1±CV）?CV为该试剂的批内CV?(一般在15-20%⑵CO±2s，s为实验室做室内质控ROC的。食品药品监督管理局阳性判定值公式中的常数是在特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现试剂盒为例。根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到质控作用，试剂变质和操作不当均会产生无效的后果。ELISA定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关，因此QC）要保证试验的灵敏度和。①选择质量较好的试剂;②订购长批号