平颏海蛇毒磷脂酶A2基因的多样性.docVIP

平颏海蛇毒磷脂酶A2基因的多样性 生物化学与生物物理 ACTABIOCHfMfCAetBIOPHYSfCASINICA2I】0l,33(3J:345—350CN3113∞/l. ,………, 研究简报 ,………. 平颏海蛇毒磷脂酶A2基因的多样性 杨文利卫剑文钟肖芬赵贵军彭立胜吴文言徐安龙 (中山大学生命科学学院生物化系,悔洋生物功能基网组开放实验室,广州510275) 摘要通过对乎颏海蛇毒腺eDNA文库的随机测序和PCR筛选.分离到3种未曾报道的磷脂酶^.(PLA})cD- NA,分别命名为PLA,一8,PLA～9PL42—384.这些eDNA均含有完整的读码框(长度分别为456bp,438bp和 438bp),编码含27个氩基酸残基的信号肽和长度分别为125,119和119个氨基酸的成熟多肽.运用计算机软件 推算PL一8,PLA2—9和PL384的等电点分别约为48,78和8.4.氨基酸序列分析和二级结构预测表明,3种 PL均属I类磷脂酶家族,其中PLA28与来自澳大利亚虎蛇Notechisscutatussc~tatus的PLA2有81%的同源 性;而PL9和PL一384则与来自海蛇Enh3drir~zschistosa的肌毒PL有90%的同源性,这不仅预示着他们 在功能上可能存在某些相似性,也反映出平颠海蛇PL的结构多样性.这组海蛇PLA2同功酶基目的成功克隆 为进一步揭示PL的结构j功能关系及可能的分子机制提供了新的信息. 关键词平颏海虻;磷脂酶A2;序列分析;f类;多样性 磷脂酶(phospholipase,EC,简 称PLA.)广泛存于在各种蛇中,是蛇毒腺中含量最 丰富的一种酶,由一类结构相似,分子量在14kD 左右的蛋白质家族组成.该酶在0存在的情况 下能催化磷酸甘油酯Sn一2酯酰键的水解,生成溶 血磷脂和脂肪酸_1J.蛇毒PLA2除了酶活性外,还 具有多种生理活性,如神经毒l,心脏毒【3J,肌 毒-,细胞毒51,溶血作用【,抗凝集作用【一等,这 些活性往往独立于酶活性之外.不同来源的蛇毒 PLA所具上述生理作用各不相同,一种蛇毒中又 往往含有PL的多种同工酶.PLA2这种特有的 化学性质和复杂的生理功能不仅使其成为研究脂代 谢,生物膜磷脂结构和酶系脂蛋白间相互作用以及 有关凝血和溶血机制方面的重要工具酶J,而且作 为药物在治疗肿瘤L,心血管疾病L等病症方面也 有着重要的应用前景目前,已报道的PL氨基 酸序列约有170种,根据它们在一级结构及二硫键 模式上的差异,可划分为不同的类群.如来自Elap— idae和Hydrophidae类的蛇毒PLA2属I类,来自 收稿日期:200012.接受日期:200】0l一17 国家863高技术海洋领域资助项目,N本文中报 道的棱苷酸序列已收人Genl~k,蹦8,PLA29和2384的 接受号分别为AF144319AF2G5378和,~144320 联系人:Td,02084113656;Fax,(12084038377 ern】.Ls36@m剥ucn Crotalidae和Viperidae类的蛇毒PLA2属II类1. 2(】世纪90年代以来,随着基因工程技术的飞速发 展以及由环境问题所带来的蛇资源减少,利用重组 DNA技术进行蛇毒PLA2的结构与功能关系研究 已在陆地蛇中广泛开展,迄今,已有来自眼镜蛇, 台湾金环蛇,江浙蝮蛇等陆地蛇的PLA2基因被先 后克隆和表达,人们还通过定点突变,同源模 建等方式对部分蛇毒PLA2的酶活性相关位点以及 酶活性与其他生理活性的关系进行了研究l1J. 海蛇广泛分布在印度洋和太平洋的热带水域, 大约有50种,它们分属于海蛇亚科和扁平海蛇亚 科.由于海蛇毒腺中含有丰富的毒性蛋白质和酶, 且毒性远高于陆地蛇l如一,一直是人们进行理论研 究和药物开发的对象.然而,天然海蛇毒素含量低 使其研究远落后于陆地蛇.本研究以我国南海平颏 海蛇为研究对象,通过构建平颏海蛇毒腺cDNA文 库及文库克隆的随机测序和PCR筛选,分离到3 种未曾报道的PLA2全长eDNA基因,为丰富蛇毒 PLA2家族,进一步开展重组海蛇PLA2的表达及 结构与功能研究提供了新的信息 l材料和方法 1.1材料平颏海蛇(Hydrophiinae,Lapemis hardwickiiGray)采自广西北海市;质粒载体pcD+ NA3为Invitrogen公司产品;mP,NAPurification ACFABICCHIMICAetB10PHYSI(ASINI(1A Kit,TimeSaveTMcDNASynthesisKit和Directional CloningToolb0x为AmershamPham~acia公司产品; DNA限制性内切酶,DNA连