细胞培养的个人体会2013.9.10.pptVIP

细胞培养的个人体会 肖 飞 (Jinan university，5350877@) 内部交流，仅供参考 体外培养（in?vitro?culture）：是将活体成分或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外 环境中，让其生长和发育的方法。 可分为器官培养、组织培养、细胞培养三种类型。 细胞培养分为原代培养和传代培养。 简化环境因素、排除了体内实验时一些复杂的因素的影响，利于应用各种物理、化学和生物等外界因素探索和提示细胞生命活动的规律； 提供了大量生物性状相同的细胞，特别是人的活细胞材料作为研究对象。经济、便利，解决了不能用人做实验的问题。 缺点是无法模拟体内的情况，结果有局限性。 培养瓶、培养管、细胞培养板、蓝盖瓶、吸管； 离心管、细胞冻存管、1ml 、5ml EP管； 血细胞计数器； 恒温磁力搅拌器、恒温水浴振荡器； 刀、剪、镊解剖用具，200目不锈钢网； 大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上， 添加了氨基酸、 维生素和与血清中浓度相似的营养物质。 选择培养基很重要，不同细胞需要适合的培养基。 常见的培养基有：DMEM、F12、DMEM/F12、1640等。 血 清 一般是从牛的血液中提取，含有丰富的营养养物质。 常用的胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS),使用前分装50ml离心管，-20℃保存。注意解冻分装前请混合均匀。? 使用时放在4 ℃冰箱解冻，需1-2天。 完全培养基 血清和基础培养基按一定比例混合，一般配制含10-15%血清的培养基，用于细胞培养。 如取20ml 胎牛血清，同时加入180ml DMEM基础培养基，即可配成200ml含10%胎牛的 DMEM. 细胞复苏与冻存的原则是“慢冻速融”。 复苏细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5℃～0℃。 冻存细胞时，向培养基中加入保护剂二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，减少 细胞冰晶的形成。 1、准备好37℃水浴烧杯。 2、将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入37～40℃水浴中使其在1min内融化。 3、无菌条件下打开冻存管，取细胞悬液至离心管中，补加5mL培养液，1600 rpm低速离心5min。 4、去上清，加入新鲜培养液适量，吹打成细胞悬液，转入培养瓶中，置37℃培养。 个人方法 复苏前，准备好含有5mL培养基的培养瓶，放入37 ℃培养箱。 1、 准备好40℃水浴烧杯。 2、 将冻存于液氮中的冻存管取出，还原保存盒放入液氮中。 将取出冻存管迅速放入水浴中，迅速摇晃加速其融化， 放在水浴中，5min钟内须完成。 3、 将冻存管放入15mL离心管（剪去底部的旧离心管）中， 1500rpm，离心3min。 4、 从离心管中取出冻存管，小心吸去上清，从培养箱中取出 培养瓶，加入37 ℃的培养液1mL，吹打30次，转入培养瓶 中，置37℃培养。 1、胰酶消化，加含血清培养基终止，离心。 2、去上清，加入冻存液1.5mL，吹打60次，转入冻存管。 3、冻存管放入4℃ 30 分钟 --- -20℃ 60 分钟 --- -80℃ 16 - 18 小时(或隔夜) --- 投入液氮中。 3、或冻存管置于程序降温盒中，放置-80℃，--- 投入液氮中。 贴壁期:0.5-4h 潜伏期:5-24h 对数生长期:24-96h 停止期（衰老期）:96h以上 全换液：完全吸除瓶内旧培养液，向瓶内加入约4-6mL培养液。置37℃培养，适合于普通细胞。 半换液：吸除瓶内一半的旧培养液，向瓶内补加入约 3mL培养液。置37℃培养。适合于生长较慢的细胞。 细胞铺满瓶底80%，吸除瓶内旧培养液，向瓶内加入少量约1～2mL消化液（一般含胰蛋白酶、EDTA），轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面； 在37℃环境下孵育1-2min，把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大。 加入含血清培养基，终止消化，用弯头吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使之脱落，吹打成细胞悬液。 转入离心管，1000-2000 rpm，离心5min。 去上清，加入新鲜培养液适量，吹打成细胞悬液，以1：2或1：3的比例接种在新的培养瓶内，置37℃培养。 细胞铺满瓶底约80%，吸除旧培养液，向瓶内加入 600uL胰酶，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍细胞表面； 吸除胰酶，在培养箱中孵育1-2min，把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大。 加入新鲜培养液2mL，吹打成细胞悬液，以1 ：2或1 ：3的比例接种在新的培养瓶内（已预加新鲜培养基3ml