细胞悬浮培养与次生代谢物质生产a.pptVIP

1983年，日本三井石油化学工业公司在世界上首次成功地采用紫草细胞培养工业化生产紫草宁。 北京锦绣大地农业股份有限公司/index.html 1.1 植物代谢产物 （1）初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必须的代谢。初生代谢过程中形成的各种产物为初生代谢产物。初生代谢产物不稳定，在体内容易发生转化。 （2）次生代谢：建立在初生代谢基础上，对于植物的正常生长发育非必需的代谢，其代谢产物为次生代谢产物，次生代谢产物是末端代谢产物，比较稳定，可以在体内积累。 类别 次生代谢产物 用途 黄酮 银杏黄酮，大豆黄酮 治疗心血管疾病 醌 紫草宁 抗菌、抗炎、抗病毒、止血 简单酚类 香豆素 香料，抗菌消炎 萜 类 紫杉醇 抗癌 青蒿素 抗疟疾 生 物 碱 长春新碱 抗癌 奎宁 抗疟疾 长春碱： ＄ 2 million/kg 长春新碱： ＄ 15million/kg 李时珍在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。天然的次生代谢产物已经超过2万种。 次生代谢产物的应用：色素、香料、药物、添加剂、工业原料等。 1.2 获得植物次生代谢产物的方法 细胞培养是生产次生代谢产物的理想途径： ①缩短周期，提高生产效率 植物细胞培养生产周期为15-30d；而完整植株生长短则几个月，长则数年，如木瓜8个月，而紫草为5年 ②易于管理，减轻劳动强度 ③培养在无菌条件下进行，可排除病虫害干扰 ④可探索新的合成路线，获得新的有用物质 1.3 植物细胞悬浮培养：即是将植物细胞或小的细胞团在液体培养基中进行大规模培养的技术。 2 细胞的初始培养 实验中获得适宜于悬浮培养的细胞系的过程称为细胞的初始培养。 2.1建立悬浮系 搅拌培养； 旋转振荡培养； 旋转培养 李忠光，龚明. 2006.7 4. 悬浮培养初期的控制 转速，光，温度 5. 悬浮细胞的继代与选择 继代中收集小的细胞团 条件培养基：新鲜培养基 3 高产细胞系的筛选(P113) 3.1高产细胞系 筛选的整体思路 高产细胞系的建立 高产细胞株系的特点 培养细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物 细胞生长及产物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物 代谢产物要在细胞中积累，而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中 高产细胞系的筛选过程 ⑴选定特定起始材料 ①准确选择能够产生目的代谢产物的植物种类、品种或单株 ②应尽量选择自然状态下产生天然产物的组织或器官为外植体 ⑵诱导愈伤组织，并获得单细胞悬浮液 ⑶诱变处理细胞悬浮液，筛选目的突变细胞 ⑷通过单细胞培养突变细胞，获得突变细胞无性系（即突变细胞愈伤组织获得） 高产细胞系的筛选方法 ⑴目测法 注意：真正的变异体or生理状态不同的细胞克隆 ⑵根据单细胞克隆次生代谢产物含量进行筛选 ⑶抗性筛选 如：添加抗性抑制剂 庚二酸------生物素 ⑷诱变筛选 3.2 高产系的稳定性及保存方法 尽量减少继代次数，用矿物油包埋法，低温保存法（0-4℃），超低温保存法（-196 ℃）保存。 同时从高产系中不断克隆形成新的高产细胞系。 4 植物细胞悬浮培养的方法 悬浮培养：将游离的细胞或者细胞团按一定密度，悬浮在液体培养基中，不断搅拌或者振荡培养，使细胞快速、大量增殖。 技术难点： 通气、剪切力的适应性；细胞同步化控制。 ①培养：培养基：基本培养基+CTK/AUX 培养条件：温度、氧气、PH、转速 ②同步化控制 ③细胞增殖的监测，适时测定细胞的数量，掌握放罐时机。 4.1 细胞悬浮培养的方法(P117) 分批培养法 连续培养法 半连续培养法 细胞固定化培养 分批培养：把细胞分散在一定溶积的培养基中进行培养。 注：中途不添加也不更换培养基 悬浮培养细胞增殖曲线 半连续培养：在完成分批培养的一个周期 后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只 保留小部分细胞悬液