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电喷雾质谱及其在生物医学分析中的应用 国家生物医学分析中心 王红霞 电喷雾质谱的原理 电喷雾质谱的特点 电喷雾质谱在生物医学中的应用 Q-TOF的应用 分子量测定（蛋白质、核酸、有机小分子） 二硫键分析 肽的从头测序 蛋白质的鉴定 翻译后修饰的测定 N-端乙酰化的分析 磷酸化位点的测定 泛素化位点的分析 多肽测序－质谱法测定蛋白质序列 VDAC位于线粒体外膜上，提供腺嘌呤核苷酸、Ca2+和其它代谢物进出线粒体的通道。缺失线粒体VDAC的小鼠的学习能力和突触可塑性能力都有所减弱，而且用低剂量环孢菌素阻断通透性转换孔能显著减弱海马的长时程增强效应。表明VDAC1可能与吗啡依赖有密切的关系。目前没有见到有关VDAC1 N-端乙酰化的报道。 磷酸化是蛋白质最普遍、最重要的翻译后修饰之一，哺乳细胞中大约1/3的蛋白质被认为与磷酸化修饰有关。蛋白质可逆磷酸化对许多生物化学功能起调控作用，是一种普遍的调控机制。 (K)FQSEEQQQTEDELQDK(48-63) MW. 1980.86 2060.82 (phos) (M+2H)2+: 991.43 1031.41 泛素化位点的分析 泛素在蛋白质降解过程中扮演着重要角色。它是由76个氨基酸残基组成的多肽，分子量约8.5Ku，高度保守，存在于所有真核细胞内。因其存在丰富而广泛故被称之泛素。它主要的作用是以多聚泛素链的形式与要降解的底物蛋白结合，从而标记底物蛋白，以便于下一步降解蛋白。泛素就像标签一样，被泛素化的蛋白质通常就会发生降解。 思考题： 1 ESI-MS的特点是什么？ 2 什么是 nanoESI-MS？它的优点是什么？ 3 质谱测序和N-端测序的比较 电压依赖型阴离子选择性通道1(VDAC 1) N-端乙酰化修饰的鉴定 斑点209的MALDI-TOF-MS的PMF及数据库检索结果 斑点209的ESI-MS图 ESI-Q-TOF测序数据进行数据库查询的结果 斑点209质荷比m/z为481.27、687.86的双电荷肽段 斑点209质荷比M/Z为1195.70的肽段的ESI-Q-TOF序列分析结果 蛋白质磷酸化研究中的应用 磷酸化蛋白质 酶切、脱盐 酶切肽段混合物 母离子扫描 m/z 79 中性丢失扫描 49 选择出磷酸化肽段 对磷酸化肽段进行MS/MS测定 Positive mode MS/MS数据 IMAC 磷酸化酪氨基酸 母离子扫描 216.043 正离子方式 磷酸化肽段 MS/MS测定 MS/MS数据 MS/MS数据 用sequence tag 查寻数据库 磷酸化数量及位点 电喷雾串联质谱研究蛋白质磷酸化流程图 用Massseq软件分析磷酸化位点 母离子扫描-中性丢失49寻找磷酸化肽段 ESI-MS of tryptic digestion fragments of beta-casein Zoom Scan of peptide with m/z1031.45 MS/MS sequencing result of double charge ion m/z 1031.45 β-casein 胰蛋白酶酶解后肽谱 β-casein 酶解混合物经 IMAC 提取后的肽谱 Information of beta-casein from Swiss-Prot Information of beta-casein from Swiss-Prot 3. 二硫键分析 3种二硫键方式的蛋白样品直接经trypsin酶切后有各自的特征肽段：? 方式1：T1-T7：4195.99Da；T9-T18：3655.80Da； 方式2：T1-T9：2164.08Da；T7-T18：5687.70Da 方式3：T1-18：2905.33Da；T7-T9 ：4946.46Da 酶切-还原法： m/z 2164.30和m/z 5688.18两个峰消失！ 图中m/z 708.38和m/z 1458.90 分别为T1和T9，m/z为2200.22和m/z 3490.98分别为T7和T18，证明该样品的二硫键连接方式为Cys5-Cys90和Cys44-Cys139。 质谱测序和Edman 降解测序的比较 串联质谱图中肽段裂解方式及命名 串联质谱中形成的6种主要离子形式 Sequence of Leuprorelin (E*HWSYLLRP*) 蛋白质鉴定 (25min) * * * * * ESI mass spectrum of peptides 分子量3072.56肽段的ESI-MS/MS测序图 N-端乙酰化是真核细胞中蛋白质最常见的修饰之一，不同蛋白质N-端乙酰化的生物学功能不同，有些情况下，N-端去乙酰化会降低蛋白