中肺合剂对Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞增殖及凋亡影响.docVIP

中肺合剂对Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞增殖及凋亡影响摘 要:目的:观察中肺合剂以Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法:取C57BL/6小鼠50只,接种Lewis肺癌瘤株后,随机分阴性对照组(0.9%生理盐水),中肺合剂低、中、高剂量组(12.7g#8226;kg-1、25.4g#8226;kg-1、50.8g#8226;kg-1),阳性对照组(CTX组,30mg#8226;kg-1),每组10只。观察12天停药。无菌条件下取肿瘤组织,采用EnVision免疫组化染色法测定肿瘤组织中Ki-67增殖抗原的表达,采用TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡指数并对凋亡指数等级评分。结果:中肺合剂低、中、高给药组能不同程度降低Lewis肺癌小鼠肿瘤组织Ki-67抗原的表达,以中剂量组最显著,与生理盐水组相比统计学上有明显差异(P75%为(++++)。并以“+”和“++”为弱阳性,低表达,以“+++”和“++++” 为强阳性,高表达。② 凋亡指数与等级评估:参考Adrien Negoescu 等[2]的评判标准,在荧光显微镜下激发绿色荧光的细胞为凋亡细胞。具体为:①单个散在分布。②具有凋亡的核形态(核固缩或染色质浓聚附边或核碎裂)。③周围无炎症反应。对于缺乏凋亡核形态的阳性细胞,除非激发荧光强度与背景有鲜明对比,且呈单个分布,否则不认为是凋亡细胞。于高倍视野(×400)下计数1000个细胞,计算阳性细胞百分率,即凋亡指数(apoptosic index,AI)。根据AI值对肿瘤细胞凋亡进行等级评估:30%为(++++)。 1.6.7统计学处理运用SPSS 16.0软件对相关数据进行统计学处理。计量资料采用(±s表示,两组间计量资料比较采用t检验,两组间率的比较采用χ2检验(Fishers精确检验)。 2结果 2.1Ki-67 表达结果 Ki-67增殖抗原阳性表达细胞在荷瘤(生理盐水)对照组、中肺合剂低、中、高剂量组、CTX化疗组中数量及表达强弱不一。生理盐水组阳性细胞数量最多,强阳性表达率为70%,阳性信号表达强,多为棕褐色。中剂量给药组和CTX组阳性细胞数较少,强阳性表达率都为10%,阳性信号表达较弱,以浅棕色居多。低、高剂量组阳性信号表达较强,强阳性表达率都为50%和30%,以深棕黄色占多。具体结果见表1和图1。经统计学处理,生理盐水组Lewis 肺癌组织Ki-67蛋白强阳性率明显高于中剂量组和化疗组(P0.05)。 2.2TUNEL检测结果 荧光显微镜下发现低、中、高给药组和CTX化疗组都有不同程度的肿瘤细胞凋亡,其凋亡指数分别分5.64%、15.42%、8.42%和21.3%,凋亡指数等级评分都大于等于“++”。以中剂量给药组和CTX化疗组诱导肿瘤细胞凋亡显著,低、中、高给药组和CTX组与生理盐水组相比,都有显著的统计学差异(P0.01)。具体见表2和图2。 3分析与讨论 Ki-67抗原是Gerdes等[3]在1983年发现的一种人类增殖细胞中普遍存在的的标志性抗原,为目前较为肯定的核增殖标志基因,它是一种贯穿表达于增殖细胞中的核抗原,出现在除G?0期和G?1早期,所有细胞同期的特异性非组蛋白,其基因固定位于人第10号染色体,是由相对分子质量为345×103和395×103的2条多肽链组成的核蛋白,基因全长分别为1115kb和1215kb,由15个外显子组成,在维持细增殖活性中起重要作用[4-5],Ki-67的表达与细胞周期密切相关,它在G?1后期开始表达,在S期和G2期逐渐升高,M期达到高峰,有丝分裂后迅速降解消失,半衰期仅为1h或更短[6],与目前通常检测的增殖核抗原PCNA相比,PCNA在G?0～G?1期细胞中无明显表达,G?1晚期其表达大幅度增加,S期达到高峰,G2～M期明显下降,Ki-67抗体在G?1期开始表达,S期和G2期逐渐增加,M期达到峰值,有丝分裂后迅速降解,G?0期不表达,半衰期短,阳性表达覆盖整个有丝分裂期,检测结果明显优于半衰期长的增殖细胞核抗原(PCNA)[7-8],其表达过度往往提示细胞增殖过度。因此Ki-67大大减少了PCNA检测可能出理的假阳性或假阴性结果,且Ki-67背景干扰小,更能直接反映肿瘤细胞的增殖活性。并与恶性肿瘤的发展、转移及预后高度相关。因此是一种准确可靠的检测细胞增殖状态的指标[9-10]。 细胞增殖抑制可导致细胞死亡或者凋亡。近年来,细胞凋亡越来越受到关注。凋亡一词在1972年由Kerr等首先提出。细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death,PCD),是由于机体内、外环境变化或死亡信号触发,在基因调控下引起细胞主动死亡的过程[11-12]。细胞凋亡对于多细胞生物