MTT法及水溶性四氮唑(WST-1)法检测中波紫外线照射HaCaT细胞后活力比较.docVIP

MTT法及水溶性四氮唑(WST-1)法检测中波紫外线照射HaCaT细胞后活力比较[摘要]目的：观察中波紫外线照射后HacaT细胞活力的变化并探讨水溶性四氮唑(wsT一1)法检测的适用性。方法：将HacaT细胞分为对照组(假照射组)、300J／m2、600J／m2、900J／m2紫外线照射后24h组(每组6个样本)。600J／m2紫外线照射后4h组、8h组、12h组、24h组、48h组、72h组(每组6个样本)。血球计数板计算HacaT细胞数量。四甲基偶氮唑盐(MTT)法和水溶性四氮唑(wsT-1)法活性测定HacaT细胞活性。结果：MTT法显示300J／m2、600J／m2、900J／m2紫外线照射HacaT细胞24h后光密度(OD)值明显较OJ／m2组低；wsT-1法各组OD值明显比0J／m2组低。MTT法显示600J／m。紫外线照射HacaT细胞8h、12h、24h、48h、72h后0D值明显比0J／m2组低。wsT-1法显示600J／m2紫外线照射HacaT细胞4h后OD值较OJ／m。组低；600J／m2紫外线照射HacaT细胞8h、12h、24h、48h、72h后OD值明显比0J／m2组低。wsT－1法的OD值与细胞计数、MTT法0D值呈正相关。结论：随着紫外线剂量的加大和照射后时间延长，HacaT细胞数量减少，细胞的活力下降，wsT－1代谢活性亦降低，呈时间和剂量依赖性。HacaT细胞可对wST一1进行代谢，适用于该细胞增殖研究。 [关键词]MTT法；水溶性四氮唑(wsT－1)法；中波紫外线；HacaT细胞 [中图分类号]Q813．1+1 [文献标识码]A　[文章编号]1008―6455(2007)02－0162－04 传统检测细胞活力方法如MTT法，过程较复杂，而新的方法如水溶性四氮唑(WST-1)法较直接，但WST-1是否能对HaCaT细胞代谢，目前国内未见报道，为了证实WST一1法可适用于检测HaCaT细胞活力，本研究用MTT法和WST-1法检测中波紫外线照射HaCaT细胞后的活力，并进行比较，结果较满意，现报道如下。 1材料和方法 1．1主要试剂：四甲基氮唑盐(MTT)一Sigma：水溶性四氮唑(WST一1)试剂盒(Boehringer Mannheim公司)。 1．2细胞株：HaCaT细胞株(武汉细胞库)。 1．3主要仪器：紫外线灯(上海长兴机械厂，功率16W，波长为280～320hm，波峰值302nm)；紫外线强度检测仪(上海宝山顾村电光仪器厂)；BCM-100型超净工作台(苏州市苏净集团)。 1．4细胞计数方法 1．4．1将HaCaT细胞接种于24孔培养板中，接种细胞数为2×104个／孔，待细胞长至50％～60％铺满瓶底时，以PBS液置换培养基，给予不同剂量紫外线照射，照射完成后换为培养基，继续培养24h。另6组给予600J／m。紫外线照射，照射完成后换为培养基继续培养不同时间。 1．4．2加0．2ml胰酶消化，同时加0．1ml全血清灭活后用细胞计数器计算。加D-Hanks液0．8ml和0．3％台盼蓝0．1ml后，用滴管取混合均匀的细胞悬液适量滴入血球计数板，于低倍镜下计算四角四个大中格内活细胞数(即透明未着色者)，按公式(四大中格细胞数／4)×10。=细胞数／m1计算(每一中格体积为O．1inm3)。 1．5 MTT法活性测定HaCaT细胞活性 1．5．1将HaCaT细胞接种于96孔培养板，每孔5×103个细胞，倒置显微镜下观察，待细胞长至50％～60％铺满瓶底时，以PBS液置换培养基，给予不同剂量紫外线照射，照射完成后换为培养基，继续培养24h。另6组给予600J／m2紫外线照射，照射完成后换为培养基继续培养不同时间。 1．5．2去除细胞培养基，用PBS冲洗3次后，加入100ul含有lmg／mlMTT，继续培养4h，弃上清液，加二甲基亚砜溶解，振荡15min(300rpm／rain)，酶标仪490nm波长检测光密度(OD)值，即MTT检测值。 1、6 WST一1法活性测定HaCaT细胞活性：细胞培养同1．5．1。每孔加入即用型WST-1溶液10ul／孔，继续置37℃ 5％C02细胞培养箱孵育90min，取出培养板置振荡器上充分振荡(300rpm)lmin后在酶标仪450／630nm双波长检测光密度(0D)值，即WST―l检测值。每次实验均设一个空白对照组，对照孔吸光值应 1