ADSC-bFGF对大鼠腹壁成形术后TRAM皮瓣活性影响.docVIP

ADSC-bFGF对大鼠腹壁成形术后TRAM皮瓣活性影响[摘要]目的:研究脂肪来源间充质干细胞复合碱性成纤维细胞生长因子(ADSC-bFGF)对大鼠腹壁成形术后腹部横行腹直肌肌皮瓣(TRAM flap)活性的影响。方法:体外分离、培养、鉴定SD大鼠ADSC。建立大鼠腹壁成形术模型。分别给予A组(ADSC-bFGF)、B组(ADSC)、C组(纤维蛋白凝胶)及D组(生理盐水)。所有动物腹壁成形术后一个月建立TRAM皮瓣模型。术后7天测定皮瓣成活面积、组织学观察和微血管密度(MVD)。结果:A、B、C、D四组的皮瓣存活率分别为(69.40±2.81)%、(66.19±2.32)%、(46.69±2.41)%和(43.77±3.55)%;A、B、C、D四组的毛细血管密度(根/mm2)分别为:(65.30±2.19)根/mm2;(59.99±2.41)根/mm2;(44.71±2.21)根/mm2;(42.44±3.22)根/mm2。皮瓣成活率A组与B组差异有意义(P 1材料 1.1 设计:采取随机,对照,动物实验。 1.2 时间及地点:于2010-04至2010-07在哈尔滨医科大学动物实验室完成。 1.3 实验材料:健康纯种成年雄性SD大鼠,质量为250～280g(哈尔滨医科大学动物实验中心提供),共28只。DMEM-F12培养基(美国Sigma公司),胎牛血清(杭州四季青公司,中国),CD31单克隆抗体(美国Santa Cruz公司),PV-6000通用型二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司),纤维蛋白凝胶(上海利康瑞生物工程有限公司),贝复济(珠海亿胜生物制药有限公司)。 2方法 2.1 脂肪来源间充质干细胞(Adipose derived stromal cell ,ADSC)的体外分离、纯化、扩增培养:取250～280g的雄性SD大鼠,无菌条件下采集双侧腹股沟脂肪垫,剪碎脂肪。0.075%Ⅰ型胶原酶消化1h,用含血清的DMEM-F12培养液终止消化,1500 r/min,离心10min,用含有10%胎牛血清的DMEM重悬。按3×105/cm2的细胞密度接种于25cm2塑料培养瓶,置于37℃,5%C02饱和湿度的孵箱内培养。72 h更换培养液,弃掉未贴壁细胞,以后每3天换液1次。通过反复传代可得到纯化的ADSC(图1)。 2.2 实验分组及治疗:实验动物随机分为4组,每组7只。①A组:腹壁成形术后制作TRAM皮瓣组(ADSC+ bFGF);②B组:腹壁成形术后制作TRAM皮瓣组(ADSC);③C组:腹壁成形术后制作TRAM皮瓣组(纤维蛋白凝胶);④D组:腹壁成形术后制作TRAM皮瓣组(生理盐水) 2.3 动物模型构建 2.3.1 腹壁成形术模型及治疗:健康纯种成年雄性SD大鼠,250～280g。水合氯醛(10%)腹腔注射麻醉(0.3ml/100g),麻醉完毕,将SD大鼠采取仰卧位固定在大鼠板上。 腹壁成形术的切口设计线呈倒梯形状。先描画出剑突的位置,在鼠尾方向离剑突1cm的位置设计出与腹正中线垂直的5cm上底线。向下0.5cm再设计出与该线平行的水平线。尾部方向的基底线长2cm,距上底线3cm(图2A)。0.5%碘伏消毒大鼠腹部术区,铺无菌洞巾。沿切口线切开大鼠皮肤、皮下至深筋膜层,沿头尾方向在深筋膜层掀起皮瓣,离断进入皮肤的穿支。标出两侧腹直肌腱膜,其大小为3cm×0.5cm,距腹正中线0.25cm。对A、B、C、D四组分别用ADSC-bFGF悬液(细胞为第四代)、ADSC细胞悬液(第四代)、纤维蛋白凝胶和生理盐水,分四点注射到腹直肌上(图2B)。每点均为0.1ml,总量为0.4ml/只。然后将0.5cm×5cm的皮条切除。缝合切口。实验完毕后单笼饲养,麻醉清醒后,自由供应饮食饮水。每日观察大鼠的生活状态。 2.3.2 TRAM模型建立:腹壁成形术后1个月,所有实验动物均构建TRAM模型。 TRAM皮瓣位于剑突下1cm,大小为10.5cm2。沿设计线切开皮肤后,将皮瓣从左侧的蒂部向腹白线分离。将右侧的皮瓣从外侧缘向腹直肌分离。沿腹白线和腹直肌外测沿作纵切口,将头侧的腹直肌切断,制作成以右侧腹直肌为蒂,腹壁下动脉供血的皮瓣(图3)。 2.4 皮瓣坏死的鉴定:在TRAM皮瓣术后7天进行皮瓣坏死面积的评估(图4)。术后7天水合氯醛10ml/kg腹腔注射处死动物。即刻切取全部腹壁组织(包括腹直肌),用硫酸纸描绘皮瓣成活区域范围并扫描入计算机。应用Adobe Photoshop CS2软件测量皮瓣成活面积,以成活面积/设计面积的比值表示皮瓣成活情况。 2.5 组织标本取材:根据Lineaweaver等[3]的方法,将TRAM皮瓣