黄鳝T淋巴细胞数量检测比较试验.docVIP

黄鳝T淋巴细胞数量检测比较试验黄鳝具有很好的食用价值、药用价值和研究价值。黄鳝养殖业的发展，推动了其产品加工的发展，目前已有简单包装的生鲜冻鳝片和冻鳝丝的生产，也有真空软包装的休闲食品柳叶鳝丝、醋熏鳝片及酥香鳝骨的生产，还有鳝血酒及全鳝药用酒的生产。同时，由于鳝鱼体内富含DHA和药用成分，国内外已在深加工和保健品方面进行研究开发。黄鳝的全身除了头和内脏，基本上都可用于加工生产食品和药品。因此，黄鳝的市场开发价值较大，有很好的发展空间。 早期玫瑰花环形成的T淋巴细胞是对SRBC具有高度亲和力的T细胞亚群，它与T细胞的体内外功能活性密切相关，能更敏感地反映机体细胞免疫的水平和动态变化，是目前检测细胞免疫水平最为简便快速的方法之一。在总玫瑰花环试验中，静止期和活动期的T淋巴细胞，均能与不同数量的SRBC自发形成E花环，所得E花环的百分率和绝对数可代表被检标本中全部T淋巴细胞的百分率和总数。是目前鉴定和计算外周血液和各种淋巴样组织中T淋巴细胞的最常用方法之一。通过对黄鳝T淋巴细胞的测定，可以了解不同发育阶段黄鳝的免疫活性，运用到实践上，可以对不同阶段的黄鳝的免疫力的强弱进行针对性的照料，当其免疫力弱时，可以加强防病治病的力度，从而达到科技运用到实践中的目的。 材料与方法 ·实验材料 1、实验动物 白兔:购于荆州沙市区钟鼓楼菜市场，体重1.32kg，试验前常温饲养10天。 不同规格的黄鳝15条，购于荆州花鸟鱼市场，试验前22℃饲养7天，数据如表1所示。 2、实验器材 离心机；移液枪；枪头；水浴锅；EP管；注射器；显微镜；计数板；载玻片；盖玻片；高温灭菌锅；冰箱；制冰机等。 3、实验试剂 瑞氏粉；甲醇；甘油；姬姆萨氏粉；戊二醛；碳酸氢钠；磷酸氢二钠；磷酸二氢钠；小牛血清；柠檬酸钠；柠檬酸；氯化钠；percoll分层液；蒸馏水；氯化钾；氢氧化钠等。 · 实验方法 1、黄鳝血液的制备 （1）取出黄鳝，用剪刀剪断其脊椎，使其瘫痪，失去抵抗。 （2）用剪刀对准肛门下方少许处斜向剪断尾部，将断口对准事先准备好的装有阿式液的EP管，血液自然流进EP管。 （3）当血液量少的时候可以适当轻挤黄鳝躯体，使血液能更多的被采集。 （4）将收集好的血液存放在碎冰上备用。 2、黄鳝淋巴细胞的分离 （1）将1份10?譖BS与9份Percoll贮存液混合，制成等渗Percoll悬液，此悬液被认为是100 % Percoll悬液，其密度为1.1294 g/ml。 （2）用PBS稀释100% Percoll而获得所需密度的Percoll分离液。 （3）用稀释液稀释60 %则此时的Percoll分离液比重为1.0777g/ml，即可用于淋巴细胞的分离。 （4）取5ml的Percoll分离液于10ml的EP管中，将等倍稀释的黄鳝血液0.5ml小心叠加在分离液上。 （5）将EP管放在离心机上进行离心（1500rpm/min，10min） （6）离心之后将EP管取出，可以看到EP管中有四个细胞层，从上到下第二层为淋巴细胞。 （7）用10um的移液枪小心的将这层细胞吸出，即为比较纯的淋巴细胞，将其收集好放在碎冰上备用。 3、兔红细胞的采集 （1）取5ml的注射器，用阿式液润洗。 （2）将白兔取出，按住其四肢和耳朵，让其面朝上躺着不能动弹。 （3）将注射器插入其心脏，缓缓抽出2ml血液，将血液迅速移入装有阿式液的EP管中，上下轻轻转动，让血液充分和阿式液混合。 （4）将制备好的兔血液放在碎冰上备用。 4、兔红细胞和黄鳝淋巴细胞的计数 （1）将采集好的兔红细胞稀释100倍，充分混匀。 （2）用移液枪吸取少量混液，小心的加在计数板上。 （3）将计数板放在显微镜下进行计数，计算出原兔红细胞的密度，配制出所需浓度的兔红细胞悬液 （4）用同样的方法配制出黄鳝淋巴细胞悬液。 5、玫瑰花环的形成 （1）取0.3ml小牛血清于1ml的EP管中，再加入0.3ml兔红细胞和0.1ml黄鳝淋巴细胞，混匀。 （2）将EP管放在37℃水浴锅中反应25min。 （3）将EP管取出，放在离心机里离心（500 rpm/min，5min）。 6、玫瑰花环的制片、染色及镜检； （1）将1滴反应好的培养物滴在玻璃片上，用枪头将其均与的涂抹在一定范围之内。 （2）将玻璃片放在一边让其自然干燥，干燥后滴加1滴甲醛在上面，5min后用6.4的PBS液冲洗。 （3）等其自然干燥后再滴加瑞式液，4min后再用6.4的PBS液冲洗。 （4）等其自然干燥后再滴加吉姆萨式液，4min后用6.4PBS液冲洗，干燥。 （5）每份培养液制备3份玻璃片。 （6）将制备