PCR-聚合酶链反应.pptVIP

PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR的基本原理 PCR中的注意事项 PCR的反应特点 PCR技术的应用 琼脂糖凝胶电泳操作技术 RT-PCR技术 2.Taq DNA聚合酶 1988年R·K·Saiki等人从嗜热细菌Thermns aquaticus中分离 的Taq DNA聚合酶,此酶对热稳定,95℃时仍不变性， Mg2+依赖 性、无校读功能. 注：酶的质量和浓度直接影响扩增带的强弱,如果酶的浓度过低PCR产物过少难以检测，而酶的浓度高又使试验的成本增加 3.模板 DNA：从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 RNA：新鲜组织或细胞，所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理。 注：常规的PCR中,对模板的要求并不严格.但对一些特殊的PCR如扩增大片断DNA的PCR,模板的浓度直接影响扩增的重复性,特异性和扩增的产量. 4. dNTP、模板和Mg2+ dNTP的浓度对PCR的扩增产物也有很大的影响:如在RAPD反应中如将0.1mol/L的dNTP提高到0.4 mmol/L,扩增的效果差,谱带弱,甚至无谱带. 主要原因:是dNTP同Taq酶竞争Mg2+,从而使Taq酶的作物不能充分发挥.所以dNTP作为反应原料并不是越过量越好,而是有一定范围. Mg2+是Taq酶的激活剂,一定浓度的Mg2+可促进Taq酶充分发挥聚合作用. 四、PCR技术的应用 4.1　PCR在作物研究中的应用 PCR技术问世不久,便以其简便、快速高效等特点迅速成为分子生物学研究的有力工具,特别是在DNA分子标记技术的发展上更起到了巨大的作用.现在基于PCR技术的分子标记已不下十几种,最为常见的是单引物的RAPD（随机扩增多态性DNA）,选择性双引物的AFLP(Ampli-fied Fragment Length Polymorphisms)扩增长度多态性,特异双引物PCR的SSR(SimplSequence Repeats)微卫星DNA重复序列也称为简单串联重复序列等。 这些分子标记技术已直接应用于作物的遗传图谱的构建,基因定位,遗传多样性,品系鉴定及系统发育,遗传育种的研究方面,取得了重大的进展.为作物优良品种的选育,抗病基因的克隆提供了快捷的途径. 4.2　医学方面的应用 PCR技术具有适用面广的特点,自发明以来,已在病毒感染的临床检测,癌症的临床诊断,遗传病的早期诊断中得以应用.应用PCR技术可使单个未形成病毒颗粒的DNA分子迅速扩增至诊断量;可从105~106细胞中检出一个癌变细胞;可快速简便且较为安全地进行遗传性疾病的胎儿期诊断.从而使临床分析上升到了分子生物学检测水平. 4.3　司法鉴定 PCR技术在国内已开始推广应用于司法鉴定中,并将成为司法鉴定的最有效手段之一.因为作案时在现场往往会留下毛发,血液等,但其量极微,用一般方法无法检测,而用PCR技术可从残留微量的DNA扩增大量DNA再予以检测. 总之,PCR对生物学家是很有价值的手段,随着PCR运用理论和经验的不断增长, 必将能充分挖掘PCR技术的潜力,拓宽深化生物学研究领域. 注意事项： 1、凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定， 所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计 2、用胶布封闭胶床两端时，要确保严密，以免 灌胶时有胶液漏出 3、用微波炉熔化琼脂糖时，以免突然产生气泡，使琼脂糖溢出来 4、凝胶冷却至60℃左右，立即铺胶，以防凝固 5、上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除 6、电泳前，确认样品孔位于电场负极 7、因EB存在，全部操作过程要带防护手套 逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 提取组织或细胞中的总RNA， 以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。 再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 总RNA的提取、 cDNA第一链的合成、 PCR 一、总RNA的提取 （一）RNA提取的一般步骤： TRIZOL试剂 破碎组织和灭活RNA酶：向病料中加入适量DEPC水，尽量剪碎磨后以12000rpm,4℃离心10min。 分离RNA：取上清200μL加入400μLTRIZOL，剧烈振荡1min,室温静置10min后,加入等量氯仿600μL，剧烈振荡1min,室温静置10min，12000 rpm，4℃ 离心