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聚合酶链反应(PCR)测定技术及其临床应用 许昌市中心医院检验科 2011-10 题目 1 PCR发展历史 2 PCR原理 3 荧光定量PCR的原理 4 定量PCR在临床诊断中的具体应用 5 未来的常规PCR 6 核酸分子杂交 什么是PCR? PCR及有关技术的发展历史（1） 1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。 发明20多年来，在生命科学研究中的作用以“支点”来形容却一点不为过。 PCR发明过程的简单回顾 PCR及有关技术的发展历史（2） 1985 关于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki等人在 Science 上 发 表 (R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. Erlich and N. Arnheim) PCR及有关技术的发展历史（3） 1987 当年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术专利批准。 成立于1985年底的Perkin-Elmer Cetus仪器公司 （ PECI ） 于这一年的11月推出了第一 个PCR试剂产品及第一台热循环仪。 1989 Science 报道了耐热性DNA多聚酶 Taq 酶的 发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。 Hoffmann-La Roche 公司和Cetus 开 始合作将PCR应用于临床诊断 。 PCR及有关技术的发展历史（4） 1990 Cetus科学家 D.Gelfand和S.Stoffel发明了纯 化Taq DNA 多聚酶的方法。 第一个PCR试剂盒用于HLA定量检测分析。 Cetus 科学家H. Erlich 和K. Mullis在德国临床化学领域获得生化分析奖。 1991 TaqMan 技 术 发 表。 当年11月Hoffmann-La Roche公司从Cetus获得全球 的PCR专利权。 Roche Molecular Systems 创建了单一耐热多聚酶rTth 进行RT-PCR技术，并用于临床RNA病毒检测。 耐热逆转录酶首次由Cetus科学家发现并报道。 PCR及有关技术的发展历史（5） 1992 当年3月Cetus 公司获得Taq酶、热循环扩增仪等专 利； 1993 AMPLICOR HCV*首次用于临床RNA PCR 标 准试剂盒。 Kary Mullis 1995 Kary Mullis因PCR的发明获得诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖。 PCR及有关技术的发展历史（6） 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测 1999年 西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查 300余万的血清阴性样品，分子生物学复测： HBV：47 HCV：10 HIV-1：2 -2001年剑桥资料 HIV-1血清阴性而RNA阳性 0.2-6.6% -Am. J. Chin Athol. 2000 PCR原理:实质就是体外基因复制技术 　聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase ChainReaction）， ?? 聚合酶链式反应简称PCR。 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循