第二章-蛋白质的定性定量分析.pptVIP

* 第二章 蛋白质的定性定量分析 蛋白质定性分析 (qualitative analysis) 确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质 蛋白质定量分析 (quantitative analysis) 确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量 蛋白质含量的测定方法（重点掌握） 蛋白质相对分子量测定 (SDS) 等电聚焦电泳 (IEF)（一般了解） 蛋白质的免疫印迹分析 (western blotting) 第一章 蛋白质的含量测定 蛋白质的含量测定 基于蛋白质的 元素组成特点 基于蛋白质的 化学显色反应 基于蛋白质的 光吸收特性 蛋白质元素组成的特点 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％ 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此 只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据 以下公式推算出蛋白质的大致含量： 100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100 1/16% 一、紫外光谱 (A280)吸收法 这一方法可用来快速检测溶液中是否含有 蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋 白质的洗脱峰 原 理 色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm附近 大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法 芳香族氨基酸的紫外吸收 所需时间 几分钟 优 点 快速 缺 点 核酸可引起强干扰作用 灵 敏 度 0.2 mg/ml～2 mg/ml 对蛋白质无破坏性 不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液 计算方法 标准曲线法 蛋白质浓度 (mg/ml) =1.45×A280-0.74×A260 注意事项 石英比色杯 调零所用溶液 配制标准蛋白所用溶液 光密度范围 二、Bradford检测法 这是一种迅速、可靠的通过染色法测定 溶液中蛋白质含量的方法 原 理 该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光吸收值大小计算蛋白的含量 所需时间 10 min 优 点 快速（反应时间仅需2 min） 敏感，几乎没有蛋白质损失 缺 点 用这种测定方法对蛋白质引起不 可逆的变性 灵 敏 度 25 ug/ml～200 ug/ml 对各种纯化蛋白质反应不同 计算方法 标准曲线法 注意事项 标准曲线在2.5 ug～15 ug BSA浓度 范围内保持线性关系 反应10～15 min后开始出现沉淀， 尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条 件下易发生沉淀 若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度 较准确 三、Lowry检测法 这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用，在检测之前可通过蛋白质沉淀将干扰物质去除 原 理 首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745 ～750 nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量 所需时间 40 min 优 点 一种可靠的蛋白质定量方法 不同蛋白质之间差别很小 缺 点 某些试剂不稳定 灵 敏 度 5 ug/ml～100 ug/ml 干扰物质多 反应速度慢 使蛋白质发生不可逆变性 计算方法 标准曲线法 注意事项 在加入试剂30 min后呈色达到饱 和，时间延长颜色信号减弱 许多干扰物质降低颜色反应 高盐浓度可引起沉淀 四、BCA (二喹啉甲酸)检测法 这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质的影响 原 理 在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量 优 点 与Lowry法相比几乎没有干扰物质的 影响 缺 点 蛋白质发生不可逆的变性 灵 敏 度 标准检测： 10 ～ 1200 u