第1节--克隆操作中使用的工具酶1.pptVIP

第一节 基因操作工具酶 第二节 核酸的分离纯化第三节 聚合酶链式反应（PCR）第四节 凝胶电泳系统第五节 核酸的分子杂交第六节 载体系统;第一节 基因操作工具酶;;主要内容;;1 限制性核酸内切酶;核酸酶（Nuclease）： 通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。 （1）按作用对象分: DNAase RNAase （2）按断裂核酸分子不同方式分： Endonuclease Exonuclease;限制性内切核酸酶（restriction endonuclease): 指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。;1.2 命 名;1.3 分 类;1.3.1 Ⅰ型限制性内切酶;1.3.2 Ⅲ型限制性内切酶;1.3.3 Ⅱ型限制性内切酶;(1) 基本特性;;(2) 同功异源酶(isoschizomer) ;(3) 同尾酶（isocaudamer);1.4 活性及影响因素;(3) 影响因素;2 DNA连接酶;2.1 定义及功能;OH P; 两类: ◆T4 DNA连接酶(ATP提供能量） ◆ 大肠杆菌DNA连接酶（NAD+提供能量） ;;1)不能催化两单链DNA分子连接； 2)只能连双链DNA分子的单链缺刻(nick)；不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺口(gap)。;DNA ligase 的活性;3 DNA聚合酶（DNA polymerase）;3.1 DNA聚合酶 Ⅰ;缺口;活性： 5`→3`聚合活性，3`→5` 外切酶活性，无5`→3` 外切酶活性。 用途： （1）填补或标记DNA的3`隐蔽末端； （2）催化合成cDNA第二链； （3）DNA序列测定;EcoR I 酶切末端;显著特点：热稳定性。70℃反应2h残留活性90 %； 93℃ 反应 2 h残留活性60% ；94℃ 反应 2 h残留活性40%。 应用：（1）对DNA的特定片段进行体外扩增； （2） DNA序列测定。;逆转录酶 (reverse transcriptase)： 又称RNA指导下的DNA聚合酶。 活性： 5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是带3`-OH的RNA或DNA。;逆转录酶的活性; 用途： （1）在体外以mRNA为模板合成cDNA； （2）对有5`突出末端的DNA片段作末端标记（补平）； （3）双脱氧法测序； （4）以DNA或RNA为模板合成核酸探针。;活性： 5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性，且3`→5`外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA强。 高浓度dNTP ??竟下前者活性更强。 应用：标记DNA平末端或隐蔽3`末端;活性：5`→3`聚合酶活性；有单链及双链的3`→5`外切酶活性，但无5`→3`外切酶活性； 特点：极佳的连续合成能力 应用： （1）用于长模板DNA的引物延伸反应； （2）通过单纯延伸或取代合成途径标记DNA 3`末端； （3）使双链DNA 5`或3`突出末端变平末端。;4 修饰酶;4.1 碱性磷酸酶;碱性磷酸酶的活性; 注意：CIP的比活性比BAP高出10-20倍，且CIP在SDS中68℃就可完全失活，而BAP却是热抗性酶。;来源: 前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。 功能：催化DNA进行5`→3`方向的聚合作用, 逐个将dNTP分子加到线性DNA分子3`-OH端。;末端转移酶的催化作用; 用途： (1) (主要)给外源DNA片段和及载体加互补同聚物尾巴； (2) 标记DNA片段的3`末端。;4.3 T4多核苷酸激酶T4 polynucleotide kinase (PNK);T4 多核苷酸激酶的活性（正向反应）;DNA/RNA（单链或双链）; 用途： （1）标记DNA的5`-末端； （2）使缺失5`-P末端的DNA发生磷酸化作用。;4.4 S1核酸酶;S1核酸酶的活性; 用途： (1)测定真核基因中间隔子序列位置； (2)去除DNA片段中突出的单链尾巴； (3)打开cDNA合成时形成的发夹环结构。;