高产蛋白酶放线菌分离和筛选.docVIP

高产蛋白酶放线菌的分离与筛选 生物技术二组孙凤秀、刘晓艺、陈海若 摘要：目的：从土壤中筛选高产蛋白酶的放线菌株。采用的方法：利用酪蛋白培养基培养防线菌比较产透明圈的大小来筛选。 放线菌广泛存在于土壤中，而且放线菌能产生大量的活性物质。我们已知放线菌是大量抗生素的产生菌株，放线菌还可以产生抑菌物质、蛋白质等一些活性物质。现在对于放线菌的研究已经很多，同样放线菌也有其培养的一些麻烦比如生长慢。 1．材料与方法 1.1材料 1.11取样：在曲师大幼儿园东边的种植豆子的土地里表层5到10cm土壤 1.12酪蛋白高氏一号培养基：可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g、水1000ml、PH7.2到7.4 酪蛋白培养基：干酪素0.3g，琼脂2g，水100ml。 液体培养基（高氏一号培养基不加琼脂但是要加入一些碎玻璃片或玻璃球） 1.2方法 1.21产蛋白酶菌株的初筛（1）制备土壤稀释液 称取土样1g，加入盛有99ml的无菌水锥形瓶中。振荡后静置5min，即成0.01土壤稀释液.(2)倾注法分离 按前法将土壤稀释液分别稀释为0.001,0.0001,0.00001三个稀释度,然后用无菌移液管分别吸取1ml三个稀释度的土壤稀释液于对应的无菌酪蛋白高氏一号培养基内. (3)培养 冷凝后,将平板倒置于28℃恒温培养箱中,培养5至7天观察结果,筛选出产生透明圈的菌株.挑取菌株置于液体锥形瓶中进行摇瓶培养7d. 1.21高产蛋白酶菌株的复筛 取出锥形瓶，用移液枪分别取1ml的培养液于无菌的酪蛋白高氏一号培养基培养培养4d后观察结果，挑取透明圈大的菌株再进行酶活力测定。 1.22发酵及发酵提取液的制备 （1）菌株摇瓶培养：将复筛得到的菌株于高十一号液体培养基中，28℃、140r∕min培养4d，得到发酵液。（2）发酵液提取物的制备：将发酵液移到离心管中在3000r/min离心8min得到的上清液即为去除菌株的发酵液。 1.23提取物蛋白酶活力的测定 取5ml用PH值为8的硼酸缓冲液制备的质量分数为0.6％的酪蛋白溶液于试管中，40℃下预热2min后，加入1ml体积分数0.5%，PH值为8的蛋白酶硼酸稀释液于试管中，40℃下反应10min后，加入5ml浓度为0.4mol/l的三氯乙酸终止反应，沉淀残余底物，40℃下保温20min ，使沉淀完全，用漏斗加滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定波长270nm的光密度。另以先加入三氯乙酸使酶失活，后加入酪蛋白的试管，按上述同样步骤测定光密度，作为空白对照。 2．结果分析 通过复筛得到的菌株中透明圈的大小分别为： 0.9cm - 0.1cm = 0.8cm 0.6cm - 0.1cm = 0.5cm； 通过初筛得到的菌株图片 从图片中我们可以看出：菌株的形态很小而且菌株周围的透明圈却非常大足以看出菌株的产蛋白酶的活力很高而且产量也很高。 在复筛中却没有得到菌株可能由于在复筛过程中没有的到大量的菌株也可能染菌等一些可能性。 在从发酵液中提取的粗酶液进行酶活力测定时也没有得到酶活力值。造成一下实验的失败主要是由于在进行液体培养时做的不够精确，而且时间也有点不充足。 参考文献 马桂珍，暴增海，王淑芳，吴少杰，付泓润，葛平华等的高产蛋白酶细菌的分离筛选及其种类鉴定2011, Vol. 32, No. 21 安德荣,慕小倩,刘翠娟,等.土壤拮抗放线菌的分离和筛选[ J].微生物学杂志, 2002, 22( 5): 1
3 夏觅真, 薛绍礼, 王怡, 陈首慧等的土壤拮抗放线菌的分离筛选及其抑菌物质特性的研究中国微生态学杂志
2010年6月第22卷第6期 方海红，胡好远，黄红英微生物碱性蛋白酶的研究进展 微生物学通报2002,29（2） 苗兰兰，曹龙奎，吴泽柱等的永川豆豉中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及液体培养条件的研究2009年5月农产品加工学刊