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蝉拟青霉（米克尔阿尔）中杀虫成分的分离 柴一秋，金轶伟，刘又高，厉晓腊，陈官菊，王根锷 （浙江省亚热带作物研究所，温州 325005） 在这个研究当中，蝉拟青霉子实体中可以杀死小菜蛾的杀虫活性成分首次用分离与生物试验相结合的方式被分离、纯化。在活性检测引导的方法下，蝉拟青霉子实体40%乙醇提取物经二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇溶剂依次萃取（剩余溶液为水溶组分），再经过大孔树脂、HPLC 和Sephedex LH-20 分离纯化得到杀虫活性化合物。【结果】分离纯化到一个白色粉末状化合物，浓度10 mg·ml-1，24、48 和72 h 时校正死亡率分别为（95.1±1.8）%、（97.7±1.6）%和（99.1±1.7）%。该化合物具有较好的杀小菜蛾活性，对酸稳定，对胃蛋白酶不敏感，并具有 茚三酮不显色等其它理化性质。随着社会的发展及人类对环境和生态认识的提高，发现对害虫高效，对人、环境和非靶标生物安全的生物源杀虫剂成为现代农药研发热点（（鲍文等人2000;。查尔斯等人，2001年。克里斯蒂安等。2004年，2005年邓小平和徐，周等人。 2006年，杨等人。2004年）。小菜蛾周年多代重叠发生，是高抗药性、世界性和灾害性的蔬菜害虫。所以，从蝉拟青霉发酵产品中分离杀小菜蛾的活性物质具有重要的生产应用意义和生态环保意义。蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae（Miq.）Samson]寄生蝉（Platylomia Peili koto）若虫形成的虫菌复合体称蝉花，是虫草类的古老中药（陈和刘1933）。最近国内外研究发现蝉拟青霉提取物具有多重治病活性（高野等人，2005年。金等人。 2005年旗峰等。 1990年，金等人。 2006年，王等。 2001年，陈和刘1993）。作为昆虫病原真菌，蝉拟青霉可以寄生白粉虱[Trialeurodes vaporariorum（Westwood）]；笔者的研究也发现蝉拟青霉分生孢子对菜青虫（Pierisrapae Linnaeus）具有较强的寄生性，并且致死时间快，在室内对家白蚁的致病率达到84.4%[16]，并发现其培养滤液对小菜蛾[Plutella xylostel（Lepidoptera ：Plutellidae）]和菜青虫具有杀虫活性[。蝉拟青霉不仅可以寄生菜青虫，而且其培养滤液具有杀虫活性。蝉拟青霉子实体中是否存在杀虫活性物质？这是一个很有意义而有趣的问题。【拟解决的关键问题】本研究拟采用化学分离分析和生物检测相结合的方法，从定向筛选的蝉拟青霉J-PC 菌株生物发酵获得的子实体中分离纯化具有杀小菜蛾活性的化合物。 1 材料与方法 1.1 菌株来源 蝉拟青霉菌株022017#，从发病虫体上单孢分离、筛选获得。 1.2 蝉拟青霉子实体制备[1] 马铃薯蔗糖培养基（PSA）斜面培养基24℃条件下培养7 d，转接到马铃薯-蔗糖培养液中，110 r·min-1转速摇床振荡培养3 d。1﹕10 接种量接入培养基（麸皮2﹕玉米1﹕谷糠1，并加2%果糖），24～25℃培养25 d，从培养基上剪刀剪取孢梗束（未去除孢子），60℃烘干备用。 1.3 仪器及化学试剂 仪器：TH-1 型梯度混合器（上海沪西机电厂）； LC-6 离心机（上海离心机械研究所）；Art.10 626 Lobar柱子（Merck 公司）；蠕动泵millipore510（Waters公司）；BSZ-100 自动部份收集器（上海精科实业有限公司）；Sephedex LH-20（瑞士Pharmacia 公司），Φ2 cm，长50 cm。RT-HPLC 为alliance Waters 2 690，柱子是μ-BandapaRe C18 300×3.9 mm，颗粒大小5μm。 试剂：甲醇、乙醇、乙醚和丙酮等（国产分析纯）；胃蛋白酶（美国HyClone-PIERCE 公司）；CDA-40型大孔树脂（南京化工大学）；纯水（杭州娃哈哈集团）。 1.4 RT-HPLC 参数 流动相，A 液为0.05%三氟乙酸（TFA），B 液为80%乙腈（AcN）加0.05%TFA。 流程为100% A液 4 min；65%A 液加35%B 液 10 min；62%A 液加38%B 液 6 min；100%B 液10 min；100%A 液10 min。流速（Flow）1.0 ml·min-1。检测波长（PDA）为200～400 nm。 1.5 小菜蛾来源及饲养方法 南京农业大学植物保护系吴益东教授提供的广州田间抗性小菜蛾。小菜蛾在25℃，12 h 光照12 h 黑暗的光照培养箱内饲养继代繁殖，饲养喂料采用无菌蛭石上萌发生长的萝卜苗（高5～6 cm）。 1.6 杀虫活性测定[18] 将分离提取的各组（浓度为折合成子实体干重50mg·ml-1）分用0.5%的吐温