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由HVAl基因构建的转基因小麦及其抗旱性研究  农作物 每年都要不同程度受到旱涝盐碱以及高低温等各种自然灾害的影响，，其中干旱斜坡是限制我国农业生产格局及农业可持续发展的主要因素。小麦是世界第一大粮食作物，我国小麦种植面积约321万公顷，总产量约占粮食作物总产量的百分之25以上。对小麦抗旱生理作用的深入研究，不仅对小麦抗旱育种有重要参考价值，而且对小麦旱地栽培有重要的知道意义。 小麦是我国北方的主要粮食作物。小麦灌溉是我国北方农业用水大户，干旱缺水是我国北方农业的首要问题，随着年降水量逐渐减少，工农业用水的增加和竞争，特别是地下水资源的明显短缺，研究环境协调性旱作节水农作制度将成为我国北方农业的重要课题之一。干旱和旱灾从古至今都是人类面临的主要自然灾害。即使在科学技术如此发达的今天，它们造成的灾难性后果仍然比比皆是。尤其值得注意的是，随着人类的经济发展和人口膨胀，水资源短缺现象日趋严重，这也直接导致了干旱地区的扩大与干旱化程度的加重，干旱化趋势已成为全球关注的问题。 干旱是因长期少雨而空气干燥、土壤缺水的气候现象。在我国粮食安全，资源高效利用，循环农业，现代农业和可持续发展方面有重要意义和将发挥重要作用。通过土壤农杆菌（Agrobacterium　tumefaciens）的介导，的转入中，得到转基因植株。“三亲株杂交”法这就是将分别生长的3种有关的细菌菌株混合在一起进行杂交。这则3菌株是：(i)带有精于接合作用的辅助质粒的大肠杆菌菌株；(ii)带有具外源基囚插入的给体载体的大肠杆菌菌株；(iii)具有由 Ti质粒派生的受体载体的根瘤土壤杆菌菌株。在本例中这3种菌株分别是：。pEC23、V3111SE和pRK2013。RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。 ◇建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。 ◇对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。 ◇大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。 1.1　受体植物及其培养基　品种为“”，选择培养基为MS附加0.2mg．L-1生长素，2～4mg．L-1ZT细胞分裂素，100mg．L-1卡那霉素和500mg．L-1羧苄青霉素。pEC23质粒是含有TMV54103的蛋白基因的重组质粒，是一双元表达载体。土壤农杆菌GV3111SE和穿梭质粒pRK2013 1.2　三亲杂交　pEC23质粒经三亲杂交转入土壤农杆菌GV3111SE中，得到的农杆菌转化株单菌落进一步用原位分子杂交的方法鉴定，证明GV3111SE中确实含有TMV54103蛋白基因。用不含有TMV54103蛋白基因的GV3111SE作为对照株。1.3　植物基因转化1.3.1　菌株的活化　将农杆菌GV3111SE单菌落培养过夜，4000r．min-1离心去掉含抗生素的培养液，用稀释1倍的MS溶液悬浮农杆菌，使其光密度达0.2左右备用。1.3.2　无菌苗的培养按照文献[6]的方法，种子先用φ=70%酒精消毒3min,φ=7%的次氯酸钠消毒15min,用无菌水漂洗3次，播种在MS培养基上，经3d暗培养发芽，移至光强为2000lx,光照时间为16h,温度为(25±2)℃的培养箱中培养。1.3.3　基因转化　剪取培养7～8d的无菌苗的子叶和胚轴作为外植体，浸在以上备好的农杆菌GV3111SE中3min,温和摇荡，倾出菌液，用无菌滤纸吸干外植体表面的菌液，将这些外植体放在MS培养基上共培养2d,转入选择培养基上培养。每3周换1次培养基，待愈伤组织产生小芽，小芽长出3或4个叶片时，切下小芽转入生根培养基（MS附加100mg．L-1卡那霉素和500mg．L-1羧苄青霉素）中诱导生根，1个月后根系渐渐发达，移苗于温室无菌土中培养。 1.4　转化植株Nopaline的检测　本实验所用的嵌合基因中带有NOS基因，所以转化体中应该检测到Nopal