乔伟-温下肠腑方含药血清对肺癌细胞cyclind1基因mrna表达的影响.docVIP

附件2： 项目类别 项目批准号 山东中医药大学 大学生研究训练（SRT）计划 项目任务书 项目名称：温下肠腑方含药血清对肺癌细胞cyclinD1基因mRNA表达的影响 申 请 人： 所在院部： 专业年级： 联系电话： 指导教师: 职称 批准日期： 二○○八 年 月 日 山东中医药大学 大学生研究训练（SRT）计划组织委员会 一、简表 项 目 简 况 项目名称 温下肠腑方含药血清对肺癌细胞cyclinD1基因mRNA表达的影响 项目类别 A、科技制作类； B、实验研究调查研究 批准经费 2000元 起止年月 2008.05-2008.11 项 目 申 请 人 姓 名 乔伟 性别 女 民族 汉 出生年月 1986.11 专业年级 院部 指导教师 姓 名 职 称 所在学院 项 目 组 主 要 成 员 ∧ 不 含 申 请 者 ∨ 姓 名 性别 出生年月 专业年级 所在院部 学习 状况 项目中的 分工 签字 二、立项依据（项目的意义、现状分析） 大量证明，肺癌的发生是一个多步骤多逐步演变过程，细胞过度增殖是肿瘤得以发生发展的重要因素，细胞周期调控失常是造成细胞异常增殖进而导致肿瘤发生的重要机制。P16、视网膜母细胞瘤基因蛋白参与的细胞周期蛋白D1/细胞周期蛋白依赖性激酶通路是一条重要的细胞周期调节途径。指导老师所在课题组长期的临床及实验研究表明，温下并用祛除肠腑寒毒凝滞是治疗肺癌特别是中晚期癌症患者出现 阳虚寒滞病证的有效方法，温下方选择《金匮要略方论》大黄附子汤加减，为深入研究其作用机制，我们拟在老师指导下，运用血清药理学实验方法，制备动物含药血清，体外培养A549肺癌细胞，MTT方法检测温下方含药血清抑制细胞增殖的作用，并运用细胞生物学、分子生物学技术，进行RT－PCR实验，检测对CyclinD1基因mRNA表达水平的影响，明确温下方在抑制肺癌细胞增殖中的作用。 三、项目实施方案及实施计划 实施方案 1细胞培养 人肺腺癌细胞系A549，培养于RPMI－1640培养基中，细胞单层贴壁生长。 2制备含药血清 选用SD大鼠，随机分为3组，即高、中2个剂量组（分别相当于60kg成人每日用量的10倍，5倍），对照组给等量生理盐水，给药时间和方法根据文献报道，连续给药3天，第4日早晨再给药1次，2h 后腹主动脉采血，无菌分离血清，－20保存备用。 3细胞分组与处理 A正常对照组，细胞经对照组含药血清孵育处理。 B温下方大剂量组，细胞经高剂量含药血清孵育处理。 C温下方大剂量组，细胞经低剂量含药血清孵育处理。 D温下方大剂量组，细胞经胎牛血清孵育，再加入DDP处理。 4指标检测 MTT法检测细胞增殖的生长抑制作用。 RT－PCR检测CyclinD1mRNA表达。 5统计分析 数据由SPSS12统计软件处理，多组数据之间采用方差分析。 实施计划 12008.5-2008.6，制备含药血清，配制培养基等，进行细胞培养前期准备。 22008.7-200.9，进行细胞培养。 32008.9-2008.12，RT-PCR方法检测基因mRNA表达。 可行性分析 1实验设计合理，方案可行。 2实验指导老师是长期从事中医药抗肿瘤的体内外实验研究，有丰富的经验。 3开展项目的实验场地为细胞生物学实验室及分子生物学，具备进行细胞培养及指标检测的实验条件。 四、本项目的特点与创新之处 1理论上创新，立足中医理论，“肺与大肠相表里”“治肺取之于肠”，从温下肠脏的角度干预肺癌细胞的过度增殖及对周期蛋白表达的影响。 2制备动物含药血清，从方法学上解决体外实验体系加药问题。 3在体外实验基础上，揭示温下肠腑方药抑制肺癌细胞增殖的机制。 五、预期成果 1学会并掌握细胞培养、传代、给药、消化等常规技术。 2学会并掌握动物含药血清的制备。 3学会无菌操作及RT-PCR实验方法。 4总结报告，形成论文