抗氨苄青霉素的构造及在大肠杆菌类的表达.docVIP

抗氨苄青霉素的构造及在大肠杆菌类的表达 摘要：本实验利用 PCR技术在大肠杆菌中扩增获得了一段序列 ,并克隆至 p GEM-T -easy载体 ,获得了重组质粒。经琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析 ,重组质粒的大小为4000 bp ,扩增片段大小为950bp,当重组质粒DNA转入大肠杆菌后，重组菌能在含氨苄青霉素的LB培养基上生长。 关键词;大肠杆菌 氨苄青霉素 PCR 1 材料和方法 1.1试剂 0.1mol/L CaCl溶液、LB液体培养基、氨苄青霉素、2.5 mmol/L dNTP混合物、Tap酶、引物对、LB固体培养基、大肠杆菌、PCR试剂盒、PCR试剂盒、PEGM-T-easy 载体系统、 DNA Marker 1.2器材 超净工作台、恒温摇床、低温离心机、恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳系统、PCR热循环仪、 1. 3 PCR扩增 制PCR反应体系（取 DNA 模板 1μL ,上、下游引物各0.5μL、dNTPs 2μL、Taq 酶 0.5μL ,加去离子水至 25μL） ; PCR 循环参数:94℃预变性1. 0min ,然后94 ℃变性1. 0 min ,47 ℃退火1. 0min ,72 ℃延伸 1. 5 min 。 共进行 35个循环 ,72 ℃再延伸 10. 0 min ,4 ℃保温。取 PCR 扩增产物 3μL 琼脂糖凝胶中进行电泳 ,观察扩增片段的大小。 1.4 PCR产物的回收 将 PCR产物用苯酚2氯仿混合物、氯仿各抽提 1次 ,无水乙醇沉淀 ,12 000 r/ min 离心 10 min ,弃上清 ,回收沉淀。 1.5 基因重组 将PCR 产物与 PGEM-T-easy载体系统以适宜比例混合 ,37 ℃作用 3 h ,进行纯化，在连接体系14 ℃水浴过夜。 1.6 大肠杆菌感受态 1.6.1从新活的大肠杆菌DH5菌板上挑取一单菌落，在LB培养基中37℃振荡培养12h左右，对数生长期时稀释50-100倍振荡扩大培养，OD600,0.5时停止培养。 1.6.2 取培养液1.5ml转入1.5 ml 离心管中冰上冷却10-30min,4℃、40000r/min离心10min. 1.6.3 倒尽上清液,用500（分三次200、 200、 100）ml氯化钙（冷的0.1mol/l）悬浮细胞，4000r/min离心10min。 1.6.4弃去上清液，加入100ul冷的0.1mol/LCaCl溶液，冰上放置片刻后，制成感受态细胞悬液 1.7 细胞转化 1.7.1将制成感受态细胞及连接体系摇匀，冰上放置20-30min. 1.7.2 于42℃水浴保温90s.然后迅速冰上冷却2min.立即向上述管分别加入0.8-0.9ml LB溶液培养基，使其体积到1ml。摇匀后37℃ 震荡培养45-60min. 1.7.3取上步转化细胞200μl涂于LB固体培养基上37恒温培养8-12h. 1.8 质粒DNA的提取 挑取LB培养基上生长的单菌落，经2mlLB液体培养基（含相应抗生素）37℃振荡培养12h后，8000r/min离心2min.采用碱变性法提取质粒DNA.（苯酚/氯仿/异戊醇1：1:1）400μl预冷的70%乙醇洗涤2次，4℃离心(8000r/min、7min）弃上清，沉淀在室温下晾干后再溶于20μlTE中，37℃水浴30min,以降解RNA分子。 1.9质粒DNA水解及PCR扩增分析 将提取的质粒取适量分别进行47℃水浴过夜、PCR扩增 3 结果与分析 3.1 PCR产物的鉴定 由图可知，再第6条泳带上扩增的大肠杆菌的基因片段为900bp，说明扩增成功。 DNA重组大肠杆菌分析 在含Amp的LB固体培养基上生长的为含为含PEGM-T-easy质粒的大肠杆菌菌落，并且此质粒含有抗氨苄青霉素的基因。 此平板涂布不均匀，单菌落较少，大部分成片生长。 3.3重组质粒的PCR及酶解检测 质粒经过PCR扩增及凝胶电泳分析，其分子量为950bp, 对各重组质粒进行酶切分析 ,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析 ,在重组质粒中均可获得大小约为 750 bp 的片段 ,由质粒电泳图可看出在 Markker 2000下有亮带，说明质粒提取成功，其分子量大约为4000. 参考文献: 【1】《分子生物实验指导》 魏琼 高等教育出版社 【2】大肠杆菌 F18菌毛 F亚单位基因的多样性分析 成大荣 ,徐建生 中国预防兽医学报 第27卷 第4期 学号：091201221 分子生物学实验论文 (2009级本科) 题 目： 目的基因COR转入受体细胞的方法及检测 系（部）院： 农业与生物技术学院 专 业： 生物工程