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抗肿瘤药物对细胞增殖及凋亡的影响 【摘要】 本实验室自主创新实验。本实验主要有药物对细胞对细胞增长速率的影响，药物对细胞周期时相分布及细胞凋亡的影响和细胞凋亡的形态学观察等三个内容。通过本次实验我们了解了细胞生物学研究的基本思路和理解设计实验的基本原则的同时通过实际操作，理解了细胞增值与凋亡在有机体正常生命活动中的作用及意义，掌握细胞增值与凋亡分析的基本方法。 一、药物对细胞对细胞增长速率的影响 【实验原理】 1.细胞生长曲线：一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过潜伏期进入指数生长期。在细胞到达包和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。典型的生长曲线可分为潜伏期，指数增长期，稳定期和衰退期。以存活细胞数对培养时间作图，及得生长曲线，生长曲线常用与测定药物等外来因素对细胞生长的影响。 2.利用MTT比色法测定药物等外来因素对细胞生长的影响：黄色的MTT能被活细胞线粒体脱氢酶还原成不溶鱼水的蓝紫色产物——formazan,后者被溶解所呈现的色度反映出活生活细胞的代谢水瓶，死亡细胞则没有脱氢酶活性。Formazan产生的量与活细胞数成正比。 【实验步骤】 1.溶液的配制： ①MTT母液 ②裂解液 ③药物与对照组：A（对照），B，C，D 实验步骤： 2.细胞制备： 取对数生长期的细胞，用胰酶消化计数，配制悬液浓度为2.5~3×10 个/ml。 3.细胞的接种（96孔板）： 设定调零组，对照组，假药组（8个平衡孔），每孔加入200ul细胞悬液。 4.加药处理：细胞贴壁后，弃培养基，换等体积的药液。 5.对细胞生长情况进行测定： ①配制MTT使用液：无血清的5ml培养基中加入600ulMTT母液避光混匀。②待测细胞孔，弃去培养基，每孔加100ulMTT使用液。没有细胞的孔同样重复上述操作，作为调零孔，继续培养。 6.第二天，每孔加入100ul裂解液，调零孔中也加 7.下午取出孔板，用移液器充分混匀，每孔取出150ul样品，转移到检测板中。用考热的针头挑破孔中的气泡，用酶标仪读取OD值。 8.计算每种药物的生长抑制率（细胞生长抑制率=（1—药物组OD值/细胞对照组OD值）×100%） 二、药物对细胞周期时相分布及细胞凋亡的影响 【实验原理】 流式细胞仪(Flow Cytometer):是集激 光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。 流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。 2.PI荧光探针的特性： PI（碘化丙啶）为定量细胞化学的荧光染料，能插入双链DNA和RNA的碱基对之间 ，每隔5个碱基插入一个PI分子。如样品经RNA酶消化后，样品中的DNA可特意结合PI。以紫外光和绿光激发。可发射出红色荧光。核算分子越大，则插入的PI分子越多，荧光强度越大。 3.DNA含量测定和周期时相分析： 细胞内的DNA含量随着细胞周期进程周期性变化，利用荧光探针标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内的DNA的相对含量进行测定，可分心细胞周期各时相的百分比。 【实验步骤】 实验步骤： 1.取对数生长期细胞，收集培养液（勿 弃掉），用胰酶消化，收集至10ml离心管中，1000rpm离心15分钟，取上清。 2.PBS洗一次，吹散。 3.用注射器将细胞吸起，用力打入5ml70%预冷的乙醇中，封口，4℃过夜。 4.1000rpm 15min 收集固定细胞，PBS洗一次。 5.用0.4mlPBS重悬细胞并转至1.5ml离心管中轻轻吹打。加RNase-A约3ul。 6.加PI约60ul,在冰浴中避光染色30min. 7.用300目尼龙网过滤，上级分析测定及打印结果。 三、细胞凋亡的形态学观察 【实验原理】 根据形态学变化经过，可将细胞凋亡分 为3个过程： ①凋亡开始时，细胞表面的特化结构(如微绒毛、细胞突起及细胞表面的褶皱)消失，但细胞膜依然完整，没有失去选择通透性；线粒体大体保持完整，但是偶尔也见到线粒体变大，嵴增多；内质网囊腔膨胀扩大；细胞骨架的结构有时变得致密和紊乱；染色质浓缩分布在核膜周围或一侧，呈眼球状 ②形成凋亡小体(apoptotic body)。产生凋亡小体有两种方式，一种为发芽脱落机制，首先染色体断裂为大小不等的片断，然后通过发芽起泡，与一些细胞器聚集在一起，形成一球形的突起，形成凋亡小体。另一种为自噬体形成机制，凋亡细胞内线粒体、内质网等和一些细胞内的胞质成分一起被内质网膜包裹，再与细胞膜融合后，形成凋亡小根据形态学变化经过，可将细胞凋亡分 为3个过程： ③凋亡小体形成后，被巨噬细胞或者邻近的细胞吞噬消化，此过程不影响