半枝莲多糖提取工艺及抗氧化性研究.docVIP

《半枝莲多糖提取工艺及抗氧化性研究》 实验设计方案 一、工作原理： 多糖提取方法的选择 多糖含量的测定方法较多，其中苯酚硫酸法认为是准确性较好，灵敏性较高，适用面较广的理想方法。因此，苯酚硫酸比色法测定多糖含量。在测定多糖含量时，因难以得到相应的多糖对照品，常以葡萄糖单糖作为对照品绘制标准曲线，采用分光光度法测其多糖含量。通过单因素试验和L9(34)正交试验考察不同因素和水平对提取工艺的影响，在试验过程中从不同超声波功率，超声时间，提取温度，料液比四个影响因素对半枝莲多糖提取工艺进行研究。 采用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量 苯酚-硫酸比色法原理：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙色物质。以显色后在490mm吸收值大小为指标，在一定浓度范围内，其吸光度A 与多糖浓度C成线性关系。 换算因子的测定 准确称取半枝莲多糖2 mg于100 ml容量瓶中，加少量蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取配置好的多糖溶液6．0，8．0，10．0，12．0，14．0 ml于50 ml容量瓶中，定容后从中分别吸取2 ml于比色管中，再加入1 ml新配置的5％苯酚和5 ml浓硫酸，振荡，静置30min后测量其吸光度。按下式计算换算因子： f＝w/(C×D) 式中： w为称取多糖的质量；C为多糖中葡萄糖的质量浓度；D为半枝莲多糖的稀释倍数。 多糖含量的计算： 多糖提取率(%)=( CDf×100% )÷W (其中,C为半枝莲多糖溶液中葡萄糖的质量浓度,D为多糖溶液的稀释倍数，f 为换算因子，W为半枝莲样品的质量) 药品： 半枝莲（干品）、无水乙醇、苯酚、维生素C、浓硫酸、 葡萄糖、95%乙醇 、丙酮、乙醚 、NaHCO3 、1mol/L的盐酸溶液、1mol/L的氢氧化钠溶液、磷酸盐缓冲液、1% K3Fe(CN)6 溶液、10%的三氯乙酸溶液、0.1%的FeCl3 溶液、5mmol/L 邻二氮菲、5mmol/LFeSO4 、0.2%H2O2、0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液、1 mmol/L NaNO2 溶液、新鲜鸡蛋、 pH7.4 的0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)、 25mmol/mL 的FeSO4、20%三氯乙酸(TCA)、 0.8% 硫代巴比妥酸(TBA)(用2%的三氯乙酸配制)以上药品均为分析纯。 三、仪器： 722型紫外分光光度计、电子分析天平、电热恒温水浴锅、数据超声波清洗器、微型植物粉碎机、PH计、加热板、循环水式多用真空泵、烘箱。 四、实验步骤 （一）溶液配置 1、标准葡萄糖溶液（1mg/mL）： 精确称取在温度105℃干燥至恒重量的葡萄糖100mg，加蒸馏水溶解，转移到100mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀。 2、5%苯酚的配置： 取苯酚100 g，加铝片0.1 g和NaHCO3 0.05g，蒸馏，收集182℃馏分，称取次馏分5 g，加水溶解并稀释至100mL，摇匀，置棕色瓶内，冰水浴备用。 （二）半枝莲多糖的提取 半枝莲的预处理：半枝莲2g（干品）→干燥→粉碎→过40目筛→加入乙醚浸泡脱酯（60—90沸层）—晾干—加入—定量蒸馏水浸泡。 根据仿生学原理，模仿人体胃、小肠 p H值别为2.0、7.5，准确称取2g样品，蒸馏水作为浸剂，第一次提取：模拟人体胃 pH值，用1mol/LHCl调 p H值为2.0，在一定超声时间、料液比、温度下进行多糖提取，过滤，保留滤液。第二次提取：模拟人体小肠p H值，用1mol/LNaOH分别调PH为7.5，同样在超声时间、料液比、温度下对第一次提到过滤后滤渣进行多糖提取。合并2次提取液，加入活性碳脱色，减压抽滤，滤液浓缩，用95％乙醇沉淀，减压抽滤，用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，在烘箱中60℃烘干即得到半枝莲粗多糖。 1、半枝莲多糖提取工艺单因素试验设计 （1）不同超声时间： 准确称取半枝莲2.0000g，在温度为60℃，料液比为1：40(g?ml-1)，分别在p H值为2.0、7.5蒸馏水中提取多糖。进行五次平行提取，超声时间分别为，15min，20min，25min，30min，35min （2）不同料液比： 准确称取半枝莲2.0000g，在温度为60℃，提取时间25min，分别在p H值为2.0、7.5的蒸馏水中提取多糖。进行五次平行提取，料液比分别为1：20；1：30；1：40；1：50；1：60； (g?ml-1)。 （3）不同提取温度： 准确称取半枝莲2.0000g，提取时间25min，料液比为1：40(g?ml-1)，分别在p H值为2.0、7.5的蒸馏水中提取多糖。进行五次平行提取，