引物溶解保存稀释相关操作.docxVIP

引物溶解、分装需要注意的首先拿到引物是要先快速离心一下，3000转1分钟，然后小心开盖，加水溶解，至于加什么水，有几种不同观点，加好水后用盖上盖子来回混匀5-10分钟，也可用漩涡振荡器，但不要太久，我震荡了好久，结果杯具了。最后储存于-20℃中，避免反复冻融。?观点1：引物在碱性条件下保存时间较长，双蒸水偏酸性，DNA容易降解，TE Buffer pH在7.5-8左右，弱碱性，所以我们建议用1×TE Buffer 溶解引物，并保存于-20度。观点2：TE是弱碱性，适合于引物的保存，引物若在酸性下比较不稳定。用ddH2O的话，更适合于后续的PCR操作。观点3：注意工作液千万别用TE稀释,要用DEPC水,或去离子水稀释.因为TE可以鏊合镁离子,镁离子对Taq酶活性发挥至关重要,影响PCR反应.。小结：买试剂公司做好的无DNA/RNA酶的水溶解最好，但是那个水的PH是多少我还不知道，下周一会送来，我测一下哈~另一个解决办法是：TE水溶解成100uM储存液，利于保存，用时每次做100ul或者50ul的稀释，用灭菌的ddH2O。TE Buffer的配制方法组成浓度：10mM Tris-HCl????????????????? 1mM EDTA PH=8.0配制量：500ml配制方法：量取下列溶液于500ml烧杯中1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml0.5M EDTA PH=8.0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.。??相关技术资料来自上海生工网站：　　　　 　　　　1.如何测定引物的OD值？　　用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。　　举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。　　　　　　2.怎样溶解引物？　　生工的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L（即100pmol/ul）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH6.0）或TE缓冲液（PH 7.5-8.0），开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟，防止开盖时引物散失。　　　　　　3.合成的引物应如何保存?　　没有溶解的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反复多次冻融会降低使用寿命）。使用前，将浓溶液稀释成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后进行实验。　　　　　　4.如何检测引物的纯度？　　实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,12个碱基的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的胶，60个碱基的引物用12%的胶，取0.2OD左右的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2min)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带)。　　　　　　5.一般的合成的引物在5和3末端有磷酸基团吗?　　没有，5和3末端均为-OH基。如需要加磷酸基团，订货时需特别注明。　　　　　　6.合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办?　　PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。　　1) 引物和模板是否配对，同源性有多大?　　2) 引物本身是否有立体结构.　　3) PCR反应用试剂是否能正常工作?　　4) PCR仪是否工作正常?　　5) PCR反应条件是否合适?　　如果一切正常，还无法解决问题时，生工将为您免费重新合成引物。　　　　　　7.测定了引物的OD值后发现A260/A2801.8，引物的纯度合格吗?　　由于核酸在260nm附近有强吸收，而蛋白质在280nm附近有强吸收，从生物体内提取核酸时，常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8～2.0之间)，这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同，序列很短 (通常在20～30