猪只介白素基因之非编码区与调控区单一核苷酸多态型之检测.doc

豬隻介白素基因之非編碼區與調控區單一核苷酸多態型之檢測 Identification of Single Nucleotide Polymorphisms in Non-coding and Regulatory Regions of Porcine Interleukin Genes 研究生：曾瑋婷 Tseng Wei-Ting 指導教授：劉世華 Liu Shyh-Hwa 【摘要】 介白素（interleukin, IL）為白血球分泌的細胞激素，其功能主要是調節免疫反應。IL基因單一核苷酸多態型（single nucleotide polymorphisms, SNPs）會改變基因表現，進而影響免疫反應。本研究旨在找出不同品種豬隻的9種IL基因在非編碼區（non-coding regions）和調控區（regulatory region）之SNPs位點，包括：IL-1β、IL-2、IL-4 intron 1、IL-6 intron 3、IL-8、IL-10、IL-12βintron 2、IL-10 promoter及intron 3，並以IL-10基因探討SNPs位點變異對該IL基因表現之影響。試驗1為分析與選殖11個IL gDNA片段產物（大小為241-1,136 bp）。隨後針對這些DNA片段定序、序列比對與尋找可能的SNPs位點，再依發現位點是否同時為限制酶切割位點而決定採行PCR-RFLP或ARMS-PCR作為區別基因型之方法。之後將之用於區分4種品種計22頭豬隻（杜洛克6、黑毛豬6、藍瑞斯7及約克夏3）的基因型。這22頭豬隻的血液周邊單核球（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）亦經收集，並依豬隻基因型判讀結果再決定檢測其經ConA刺激後的特定IL蛋白。結果顯示，於9個片段中發現11個SNPs。在選殖的IL-1β（intron 1）及IL-6（intron 3）片段內無發現SNPs。IL-2基因於intron 1第192鹼基處具C/T變異，且本研究所用的豬隻均為T型（22頭）。IL-10基因於intron 2有三個SNPs。其中1,161 T/C位置可以Cac8Ι截切，所有22頭實驗豬隻多為CC型（19頭），其餘為CT雜合型（3頭）。在1,170 T/C之位置可以限制酶Tsp45Ι截切，所調查之22頭豬在此位點多分佈於TT型（18頭），而4頭豬為TC雜合型。在1,475 (C/T)區之SNPs可經HpyCH4Ⅳ截切，而所調查之豬隻在此位點多為CC型（19頭），另有3頭為TC雜合型。在IL-10基因intron 3內亦發現一SNPs（2,409 G/A），可以ARMS-PCR區分。此SNPs在所調查的白豬品種（L與Y）多為AA型，而黑毛豬以GG型為主（6頭），杜洛克則分散於各種基因型態中（GG型2頭，AA型1頭及GA型3頭）。由於在IL-10所發現的SNPs位點較多（共4個），故另針對此22頭豬血中PBMC經ConA刺激後的IL-10蛋白做ELISA檢測，分析其對IL-10濃度之影響。結果發現，IL-10含量與品種有關，其中以黑毛豬最低，約克夏最高。IL-10濃度與基因型亦有關。其中在IL-10 intron 2第1,161位置帶CC型顯著高於TC型者（P 0.05），1,170位置帶TT型顯著高於TC型的豬（P 0.05），而於1,475位點亦發現具CC型其IL-10分泌量也顯著高於CT型（P 0.05），在intron 3的2,409位點帶GG型者其IL-10濃度亦會顯著低於帶GA或AA型之豬隻（P 0.05）。此外品種與此四個位點的交互作用亦顯著，但因位點和品種之組合並非完整，故此項交互作用之探討仍需累積更多資料方能有定論。綜合上述，本研究之初步結果顯示，豬隻的IL-2、IL-4、IL-8、IL-10及IL-12β基因的插入子序列或啟動子區序列有SNPs現象。其在IL-10所發現到的4個位點中有3個會影響到其在PBMC細胞IL-10的表現。 介白素、豬、單一核苷酸多態型 Abstract】 Interleukins (IL) belong to the cytokine family. They are mainly synthesized by and acted on leukocytes to regulate immune response. It was reported that IL genes exhibit phenomenum of single nucleotide polymorphysims (SNPs) to alter expression of IL genes and consequently immune response