溶解曲线问题.docxVIP

问题：融解曲线前端不太正常。1：融解曲线形成原理融解曲线是不断升温至95℃过程中采集的荧光值。也就是说在不同温度条件下，DNA进行解链，荧光染料从双链中游离出来，从而出现荧光值的降低。但是当温度达到DNA解链一半的温度时，也就是Tm值时，荧光染料会大量游离出来，从而使荧光值迅速降低，最后转换成导数后形成高峰。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而区分非特异性扩增。图一：纵坐标为将荧光强度的变化对温度的变化求导。（-dI/dT)（融解曲线呈单一峰时，表示无非特异性产物，荧光定量准确）2：融解曲线的两种不同形式图二对图二曲线每一个位置求导，负导数（-dI/dT）作为纵坐标，得到图三：图三3：红色框位置曲线解释图四融解曲线的采集过程中，温度的变化为每0.05s上升0.3℃，buffer成分（Tris-HCl）随着温度的上升，pH降低，导致SYBR Green 的荧光信号强度降低。因此在68℃-75℃度之间，虽然没有DNA双链解开，但是荧光信号发生降低。 温度在65℃-68℃之间（红色框框位置），虽然温度逐渐上升，但是荧光信号强度不变，可能的原因是：虽然温度上升，pH值降低，但是如果pH值依旧在SYBR Green完全发光的范围内，则荧光信号不发生变化。起始荧光信号过强，荧光信号在一定范围内的减弱不能被仪器检测到，因此显示的荧光信号不发生变化。4：AceQ融解曲线问题--为什么有时候在融解曲线的前端出现凹下去的曲线。以stepone one为例：图五 AceQ促解链成分相对较多，抑制退火延伸；因此在退火延伸阶段（60度，1min）存在部分链退火不充分；因此在信号刚开始采集阶段，部分链会继续退火形成双链，荧光信号增强，退火充分后荧光信号达到最大值，此后随着温度的上升，pH降低，导致SYBR Green 的荧光信号强度降低，反映在融解曲线图六中为红色框所示。图六