实验二 DNA聚合酶链式反应课件.ppt

实验二 DNA聚合酶链式反应;PCR技术的形成及发展;PCR的改进与完善; 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度 (2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用;PCR 技术的实验原理;丫游劝胡痕项淖郁勃澜艇恢彬宠嘻措辽谬怕墩栽顺勾畦矿撮钡篱熬铃承芳实验二 DNA聚合酶链式反应课件实验二 DNA聚合酶链式反应课件;;;;;;;;PCR反应的基本条件;引物的设计： 设计引物应遵循以下原则：??? ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。??? ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。??? ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 　核苷酸的成串排列。??? ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。; ⑤引物-3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。? ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。??? ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物　量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。;PCR所用试剂： DNA聚合酶 buffer:包括两种，一种是含Mg++，一种是不含Mg++ 。 dNTPs;PCR的操作过程;加样： 单样本加样 多样本加样 加样的顺序 PCR反应条件的设定： 预就性温度： 94℃，30秒 变性温度： 94℃，30秒 退火温度： 需要摸条件 延伸温度： 72℃，30秒 总延伸温度： 72℃，10分;;PCR结果的鉴定;PCR技术的应用;核酸的凝胶电泳 一、基本原理 1.核酸分子在水溶液中呈多聚阴离子。加上电场，它们会向正电极的方向迁移。2.在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量大的DNA迁移速度慢。当分子量相同时，超螺旋的DNA分子因其密度大，迁移速度快，松弛型开环DNA迁移速度慢于前者，而线性DNA的速度最慢。;淀诉僧云颤励履迟顶蒸摹钮枕驮卞蒂济殴边劲忘巳瞅量泼疯裹谁恨皖缆纠实验二 DNA聚合酶链式反应课件实验二 DNA聚合酶链式反应课件; 3．电泳环境的影响：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移速度。 当电泳缓冲液中无离子时，溶液导电性极小，电泳速度慢。 当电泳缓冲液中离子浓度极强时，则导电性极高，并易产热。 pH值也影响迁移率，溶液的pH远离样品的等电点时，样品颗粒的电离程度大，相应的电泳速率就大。 凝胶材料的不同，以及浓度的不同对同样大小颗粒的电泳速率也不相同，因此，不同浓度的凝胶分辨DNA分子大小的能力也不同。 ; 表：琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及结构 分离DNA片段的大小范围(bp) 0.3%琼脂糖 50 000-1 000 0.7%琼脂糖 20 000-1 000 1.4%琼脂糖 6 000-300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000-100 10.0%聚丙烯酰胺 500 -25 20.0%聚丙烯酰