原核生物-细菌.PPT

原核生物-細菌（細菌革蘭氏染色及細菌接種） 壹、目的： 一、細菌抹片製作以及口腔中的細菌 觀察 二、革蘭氏染色辨別革蘭氏陰性菌及 革蘭氏陽性菌。 三、細菌接種-四區劃線法。 貳、材料與方法：一、細菌抹片製作（齒垢、菌種取自固態培養基） 1.細菌抹片製作，準備乾淨玻片，在玻片底部中央處畫一圓圈，將生理食鹽水滴在玻片上方圓圈處（量不要太多，否則風乾時間加長）。 2.將接種針在酒精燈上滅菌，將洋菜平碟上的細菌輕輕取下，避免刮到洋菜，將刮下的細菌與生理食鹽水混和，塗抹（不可用力過猛，以免破壞細菌排列）。 3.將塗抹過後的玻片，自然風乾後，將塗抹細菌面朝下，在火焰上來回三、四次固定細菌。 ★注意接種針（環）使用前後都需利用火焰燒至火紅，以達滅菌效果，待冷卻後再進行抹片製作，接種針（環）不可直接放置桌上，以免污染（可放於紙巾上）。 二、口腔的細菌與革蘭氏染色： 簡介：革蘭氏染色法可以將細菌分為兩大類；革蘭氏陽性菌以及革蘭氏陰性菌；因為革蘭氏染色步驟較繁複，為了簡便，尚有氫氧化鉀分辨法以及濃硫酸分辨法。 材料：1.齒垢、菌種 2.染劑： （1）口腔細菌觀察：甲基藍液 （2）革蘭氏染色： 結晶紫（初染）、革蘭氏碘（媒染）、 95％乙醇（脫色）、番紅（複染）。 口腔細菌觀察： 將齒垢抹片加入1滴甲基藍液後，染色2分鐘，利用自來水將多餘染劑去除，再用紙巾吸乾水分（請勿擦拭）晾乾後即可觀察。 革蘭氏染色步驟 1.將固定的細菌抹片，加上結晶紫（初染液）染色一分鐘後，然後水洗（注意水洗抹片時避免水量過大，而將玻片上的細菌洗掉，宜利用滴管慢慢沖洗即可。） 2.水洗過後的抹片加上革蘭氏碘液（媒染液），染色1分鐘後，水洗。 3.水洗後，利用95％酒精（脫色液）脫色，時間大概為10秒鐘，盡量將紫色去除，再水洗一次。（★使用脫色液時，請將廢液集中處理於大燒杯內。）  4.水洗後加上番紅液（複染劑Safranin solution）染色30秒後水洗，利用吸水紙（可用濾紙）吸乾水分即可。 革蘭氏染色步驟 5.觀察細菌顯微鏡使用油鏡觀察，不必覆蓋蓋玻片。 （革蘭氏陰性菌呈現紅色；革蘭氏陽性菌呈現紫藍色） （觀察完玻片請先利用萊舒水或酒精噴過後水洗乾淨，再晾乾。） 革蘭氏陰性菌 革蘭氏陽性菌 三、細菌接種-四區劃線法 細菌接種方式：依照培養基型態與使用目的而有不同的接種方式；一般有懸浮法、劃線法、穿刺法、傾注平板法。 ★懸浮法：通常用於液態培養基。 穿刺法：針對菌種是否對氣體有需求性。 傾注平板法：用來估計液態培養物內的活菌數目。 劃線法：1.斜面劃線：用於細菌純種再培養。 2.平板劃線：厚塗法-抗生素感受性試驗。 四區劃線法-檢體分離細菌用。 四區劃線法 1.將接種環（針）在火焰上燒至火紅。 2.左手將培養皿蓋子微微打開，利用培養皿上的水氣或70％酒精將接種環（針）降溫，以免溫度太高將細菌殺死。 3.利用接種環（針）輕輕取單一菌落，且避免刮到培養基。 4.將接種環（針）於平板上1/4區劃線，再將接種環（針）取出放在火焰上燒紅，重複1～3步驟3次。 5.劃線完畢後，請記得將接種環（針）燒紅滅菌，以免感染。 6.隔天觀察細菌接種結果，利用解剖顯微鏡進行拍照，並與同組組員比較差異，並將菌盤保存，於次週利用解剖顯微鏡觀察，由教師進行解說。 叁、結果： 一、實驗菌種各為革蘭氏陰性菌？革蘭氏陽性菌？並將觀察到的細菌外觀畫出，並標示顏色。 二、顯微鏡觀察中如需要使用油鏡觀察時需注意到哪些事項？ 三、細菌接種結果及同組組員比較。 肆、討論： 一、探討細菌為何可以用革蘭氏染色作陰、陽性菌的判別？ 二、細菌接種需注意什麼？ 伍、參考文獻： * * 結晶紫1分鐘 革蘭氏碘液1分鐘 95％酒精脫色盡量無紫色 番紅液30秒 1 2 3 4 *