双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定.PDF

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2010, December 25; 26(12): 1696−1703 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ ©2010 CJB, All rights reserved. 生物技术与方法 双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定 李军华，韩翠芹，邓捷，王华岩 西北农林科技大学动物医学院 陕西省干细胞工程技术研究中心 陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌 712100 摘 要: 利用 DNA 同源重组方法 (基因打靶) 对动物基因组进行修饰是转基因研究的重要手段之一。为了构建一个高 效的通用型基因打靶载体，本研究以 pBS246 质粒为骨架，在两个 LoxP 序列之间插入正筛选标记新霉素磷酸转移酶(neo) 基因和绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因；在两个 LoxP 序列外侧分别插入两组携带“8 碱基”酶切位点的多克隆位点序列 (MCS-1 和 MCS-2) 和负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV-tk) 基因，构建成通用型基因打靶载体 pGT-V1 ，并且在 C2C12 细胞中验证了载体中各个元件的功能。该载体具有如下特点：1) 在载体中引入绿色荧光标记，可以实时监控载 体的转染效率，而转染效率的提高为高效基因打靶提供了保证；2) 在两个 LoxP 位点间插入绿色荧光标记，可以直观 监测打靶后遗留的筛选标记的去除情况，并且可以通过流式细胞仪或免疫磁珠法，将最终去除了筛选标记的阳性细胞 ( 即丢失绿色荧光的细胞) 分选出来，降低筛选标记在中靶细胞中可能产生的负面影响；3) 采用“8 碱基”酶切位点的 MCS 序列，便于 DNA 大片段的连接和重组，极大提高了该载体的通用性。总之，该载体优化了基因打靶的技术手段， 为有效开展基因打靶和转基因动物研究提供了新平台。 关键词: 同源重组，绿色荧光标记，打靶载体，Cre-LoxP Construction and functional analysis of a common gene targeting vector with double-selection markers Junhua Li, Cuiqin Han, Jie Deng, and Huayan Wang Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, Shaanxi Center for Stem Cell Engineering and Technology, College of Veterinary Medicine, Northwest AF University, Yangling 712100, China Abstract: Homologous recombination is an important technique that is used to modify mammalian genome. Here, we constructed an efficient common gene targeting vector based on the plasmid pBS246. The vector consisted two positive selection markers, neomycin resistance gene (neo) and enhanced green fluorescent protein gene (EGFP) flanked by locus of X-over P1 (LoxP) sites. Two synthesized m