定量PCR实验简明操作.PDFVIP

定量PCR 实验简明操作 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix 20 x TaqMan Gene Expression Kits 1. 模板、引物及探针用量 DNA用量：10 ~ 100 ng 每反应； cDNA用量：1 ~ 100 ng 总RNA反转录所得cDNA取1 µL。 引物和探针用量： 终浓度 (1X) 每反应用量 Probe 50-250 nM ~5 pmol/Rxn Forward Primer 50-900 nM ~22.5 pmol/Rxn Reverse Primer 50-900 nM 反应体积：5-50 µL。 2 ．TaqMan 探针法PCR 反应 试 剂 用 量 (µL) cDNA (1-100 ng RNA 反转录所得cDNA) 1 或者DNA (50 pg -100 ng，最好10 ng-100 ng) 1~2 2 x TaqMan Universal PCR Master mix 10 20 x Gene Expression kit (Probe/Primer mix) 1 H2O 8 总体积 20 PCR 循环参数： 50 °C 2 min → 95 °C 10 min → (92 °C 15 sec → 60 °C 1 min) × 40 个循环 3．SYBR Green I 荧光染料法PCR 反应 试 剂 用 量 (µL) cDNA (1-100 ng RNA 反转录所得cDNA) 1 或者DNA (50 pg -100 ng，最好10 ng-100 ng) 1~2 2 x SYBR Green PCR Master mix 12.5 Forward Primer (22.5 pmol/Rxn) 900 nM Reverse Primer (22.5 pmol/Rxn) 900 nM H2O to 25 总体积 25 PCR 循环参数： 50 °C 2 min → 95 °C 10 min → (92 °C 15 sec → 60 °C 1 min) × 40 个循环 5． 7000 SDS v1.0 软件操作 检查电脑与仪器的联线是否正常，电脑应处于外接电源供电状态。开电脑，待桌面图标出现后，再打开 7000 主机电源，然后启动SDS 应用软件。 1 新建文件 菜单File → New ，Assay 选择Absolute Quantification (实时定量模式)，打开一个空白文件。 探针设置 双击任意一个孔，打开Well Inspector 窗口。该窗口也可以从菜单View → Well Inspector 打开。 首次使用软件，或者探针（Detector）没有设置好，请点击Add De