SOD酶生产.ppt

超氧化物歧化酶（SOD）的生产 一. SOD的概述 1.SOD的概念 超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。 2.SOD的分类 按其结合的金属离子可分为Fe-SOD、Mn-SOD、CuZn-SOD三种 3.SOD的理化性质 3.1 SOD对氰化物和H2O2的敏感性 3.2 SOD的吸收光谱特性 3.3 SOD稳定性及影响因素 3.4 SOD的作用 3.1SOD的性质SOD对氰化物和H2O2的敏感性 长时间用过氧化氢处理可使CuZn-SOD和Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影响 3.2SOD的吸收光谱特性 CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪氨酸的含量较低，它在280 nm处并没有最大吸收峰。 CuZn-SOD的可见光最大吸收波长都在680 nm左右， 这反映了酶分子中Cu2+的光学特性。 3.3SOD稳定性及影响因素 PH、热、蛋白酶的影响：SOD在pH5.3～9.6间催化性能良好，在pH4.5～pH11间能稳定存在。pH3.6时， CuZn-SOD中95%的Zn要脱落，在pH12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变而使酶失活。 SOD对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当离子强度很低时,即使加热到95℃, 其活性损失也很少其他因素：SOD活性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定。另外还发现有机溶剂和Cl对SOD的活性具抑制作用 3.4SOD的作用 它催化超氧阴离子转化为H2O2和O2的反应， 即催化超氧阴离子自由基O2-·发生歧化反应， 从而清除O2-，2O2-+2H+→H2O2+O2， 在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用， 在免疫系统中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，防衰老。 实验器材及试剂 烧杯，试管，容量瓶，钵体，离心机，真空干燥箱，电子天平，恒温水浴槽，紫外分光光度计，刻度吸管，微量注射器，透析袋。 新鲜蒜瓣、0.05mol/L的磷酸缓冲液，氯仿—乙醇（3：5）混合液，50mmol/L的Tris-HCL、10mmol/L的HCL、50mmol/L的邻苯三酚。 工艺流程 破碎组织细胞 去除杂蛋白 SOD的沉淀分离 测定邻苯三酚自氧化速率 测定并计算SOD样酶活性 实验原理 邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出 O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。 操作步骤 基本步骤： 原料→清洗→破碎→浸提→热变性→高速冷冻离心→调整PH→高速冷冻离心→加丙酮沉淀→高速冷冻离心→溶解沉淀→透析→冷冻干燥→成品 操作步骤 1 组织或细胞破碎 　　称取5g左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞,至于研磨器中研磨,使组织或细胞破碎。 2、加入pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液（pH7.8）15ml，继续研磨20min,使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后6000r/min冰冻离心15min，放弃沉淀，取上清液。 操作步骤 3、加热变形除杂蛋白 　　将上清液置于60度水浴锅15分钟，使杂蛋白热变性，然后以10000r/min冷冻离心10分钟，收集上清液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。 操作步骤 4、SOD酶的沉淀分离 粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓度60%，持续搅拌15min，6000r/min离心15min，得到SOD酶沉淀 5、将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行纯化，然后超滤浓缩。 操作步骤 5、用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量 6、将浓缩冷冻干燥后即得成品。 邻苯三酚自氧化速率的测定 取两支试管加入缓冲液，然后加入预热过后的邻苯三酚（空白试管用10mol/l的HCL代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色皿中，在325nm波长处测定吸光度，每隔30s读数一次，测定4分钟内每分钟吸光度的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的吸光度为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制吸光度） 试剂 空白管/mL 自氧化管/mL 50mmol/L的Tris-HCL 2.98 2.98 10mmol/L的HCL 0.02 0.01 50mol