均匀设计优化黑木相思ISSR-PCR体系.pdfVIP

第24卷 第6期 福建师范大学学报 (自然科学版) Vo1．24 No．6 2008年 11月 JournalofFujianNormalUniversity (NaturalScienceEdition) Nov．2008 文章编号：1000—5277(2008)06—0078—06 均匀设计优化黑木相思ISSR—PCR体系 胡 薇h，陈 宇 ，林来水 ，林思祖 (1．福建农林大学林学院，福建 福州 350002；2．福建师范大学生命科学学院，福建 福州 35O1O8) 摘要：采用均匀设计，对影响黑木相思ISSR—PCR体系的引物、Mg 、dNTP、TaqDNA聚合酶和模板 DNA浓度等进行5因素5水平和5因素3水平两轮优化，建立了适合于黑木相思ISSR—PCR的体系：在2o 反应体系中，含引物 0．30btmol·L一，Mg 3．00mmol·L_。，dNTP0．15mmol·L～，TaqDNA聚合 酶0．75U，模板DNA2．oOng· _。．在此基础上对扩增程序中的循环次数、退火温度、退火时间进行筛 选，获得的扩增程序为：94℃预变性5rain；接着进行33个循环：94℃变性 35S，52～61．5℃退火52S， 72℃延伸9OS；循环结束后 ，72℃延伸 10min．同时筛选得到 10个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物． 关键词：黑木相思；均匀设计；ISSR-PCR 中图分类号：Q949．662 文献标识码：A TheUniform DesignOptimization ofISSR—PCR System inAcaciamelanoxylon HU W ei一，CHEN Yu ，LIN Lai—shui，LIN Si—zu (1，CollegeofForestry，FujianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou350002，China； 2．CollegeofLifeSciences，FujianNormalUniversity，Fuzhou350108，China) Abstract：Uniform designwasusedtooptimizeISSR—PCR system inAcaciamelanoxy— lon．FiveinfluencingfactorsonISSR—PCR，includingprimer，Mg抖 ，dNTP，TaqDNApoly— meraseandDNA templateconcentrationweretestedbyuniform design．A suitableISSR— PCR system forA．melanoxylonwasestablishedasfollows：each20 LISSR—PCRamplifica— tionreactionsolutionwasconsistedof0．30~／mol·L一 primer，3．00mmol·L一 Mg ，0．15 mmol·L一 dNTP，0．75U TaqDNA polymerase，2．00ng · “L一DNA template．Thesuit— ableISSR—PCRprocedurewas1cycleofpre—denaturingfor5minat94℃ ，33cyclesofdena— turingfor35Sat94℃ ，annealingfor52Sat52～61．5℃ ，extendingfor90Sat72 ℃ and thelastcycleofextendingfor10minat72。C．And 10primerswithstableamplificationand richpolymorphism forISSR werescreened．Meanwhile，10suitableISSR primershavebeen obtained． Keywords：Acaciamelanoxylon；unif