HPLC培训教材2题库.pptVIP

* 超声脱气比较好，10~20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声20~30min方可），此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。 * * * ①　避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。 ②　应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。 ③　一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 ④　选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 ⑤　避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。 ⑥　经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50~75ml。 ⑦　保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 ⑧　色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。 装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。 色谱柱的保养（总结） 进样阀 六通阀设计 耐高压，低死体积 可以手动或自动旋转进样阀 自动进样的重复性优于手动进样 上样(load)状态 进样(inject)状态 手动进样阀的进样 注意：一定使用平头微量进样针 进 样—层 流 效 应 当样品注入定量环时，环中的流动相将被取代 样品于流动相之间的界面呈抛物线状，称为层流效应 全定量环进样时，必须考虑层流效应的影响 进 样—层 流 效 应 以定量环的体积定量 对一般样品而言，进样体积需大于定量环的2.5倍 4 倍则更加保险 倍数 进 样—进 样 量 全定量环进样 准确，但浪费样品 至少需要2.5倍进样体积的样品 部分定量环进样 进样量 进样环体积的一半 无层流效应的影响 误差来源于进样针及操作人员 使用内标法将可以提高进样的准确度 检 测 器 作用：检测色谱柱流出物组份浓度的变化 理想的检测器： 灵敏度高 对所有溶质都有快速的相应 不引起柱外谱带扩展 线性范围宽 对样品无破坏性 检测器响应对流量及温度变化不敏感 检 测 器 分 类 按检测对象分类 整体性检测器：检测流动相的总体物理性质 如：示差折光检测器、电导检测器 灵敏度低、易受温度影响的波动、不适合梯度洗脱 溶质性检测器：测量溶质的某种特性或物化性质的变化 如：紫外检测器、荧光检测器 流动相不能有紫外吸收 按选择性分类 选择性检测器：紫外检测器、荧光检测器、电导检测器 通用性检测器：示差折光检测器 检 测 器 分 类 1）按原理分：为光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化学检测器（如极谱、库仑、安培）、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电子捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器。 2）按测量性质分：为通用型和专属型（又称选择性）。 通用型检测器测量的是一般物质均具有的性质，它对溶剂和溶质组分均有反应，如示差折光、蒸发光散射检测器。通用型的灵敏度一般比专属型的低。 专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，如紫外、荧光检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。 3）按检测方式分：浓度型和质量型。 浓度型检测器的响应与流动相中组分的浓度有关，质量型检测器的响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关。 4）检测器还可分为破坏样品和不破坏样品的两种。 检测器的噪音和漂移 噪音和漂移反应了检测器的稳定性 噪音 无溶剂通过检测器时，输出信号的变化 电路及泵的脉冲引起短噪音，不影响色谱峰的分辨率，但影响检测限 长噪音来自检测器本身、或流动池有气泡，温度及流量的变化也会引起长噪音 漂移