抗除草剂bar基因表达载体的构建及农杆菌转化的分析.pdfVIP

摘要 杂草与农作物竞争水分、养料和光照，影响农作物的产量、晶鹱，还是诲多 病害的中间寄主或越冬场所，通过除草剂米控制杂革已成为现代化农业不可缺少 的一部分。但除萆剂在消灭杂草的嗣时也对作物产生了伤害作用。题翦，利用基 因工程手段培育抗除草剂的作物品融解决了这一矛盾。 麟除草作用机理是抑制檬物的氨基酸生物台成酶一谷氮酰股台成酶(GS)，使杂 由氮基乙酰化，从而使除草荆草丁膦失活。而且bar基因也是迄今为止应用最为 广泛的一个抗除草剂选择标记基因，克隆出bar基因辩植物的遗传转化，基因袭 达和生理学研究都有重要的作用。 基因全长，并在原核表达系统中袭达，鉴定表达蹑白的活性，将能够正确缡玛PPT 乙酰转移酶的bar基因片段，经过适当的修饰构建入真核表达载体。并将此奉句建 的真核表达载体转化农秆菌获得工稷菌，为綦因转化及农栉菌转化做了前提工作。 并对农杆菌转化小麦体系作_『初步的研究，为选育出适宜在安徽麦区葶中植的高产、 优质、抗除草剂小麦新品种做了綦础工作。本实验研究结果表明： 1．利用PCR方法对已知序列纂因的党隆是简单有效的方法，但很多因素影响 PCR的特异性，其中退火温度起着关键性作用。本实验采用了离保真pfi,DNA 出特异性片段，将此片段插入克隆载体pGEM-7fZ(+)，经测序和序列分析表明， 所扩增得到的片段含有bar基因完整的读码椴，并且序列与GenBank中发表的 序列完全一致。 的片段进行表达鉴定。经IPTG诱导表达的融合蛋白的分子爨39．6kDa，目的 白酶(PAT)经DTNB比色法签定，具有酶活性。 3．为了目的基因在真核生物中有效的翻译和表达，通过PCR方法对bar基因起 始密码予ATG旁侧序列进行改选。改造后的耳的基因克隆于真梭表达载体 转入农杆菌LBA4404，成功构建出工程菌。 4．小囊离体培养中，基因型、培养基激素浓度与夕}植体类型是影响小麦胚瞧愈 伤组织诱导和辩生频率的3个主要因索。基因型的影响主要影响到胚憾愈伤组 织的发生频率，以幼胚为外植体杨麦87158可以达到81。35％，两安农92484 只能达到16．81％。在所试的品种中对于成熟胚在2,4．D质量浓度为4。0mg／L 时出愈率和胚性愈伤组织诱导率达到最大值，而对于幼胚不同品釉袭现有嬲差 母率最高，而安农92484则是在4，0mg／L时效果较好。同时研究表明不同孙植 体不仅影响到出愈率，更主要影响胚性愈伤组织的形成。 5．在转化后抗性愈伤组织筛选中，适应的PPT筛选浓度为3．0mg／L，Cef有效抑 Tween20，可以使GUS染色均匀，但并不是T．DNA转移所必需，盐的浓度对 T．DNA转移影响不丈。 关键词： bar基因茶园杂草 载体构建根癌农杆菌转化 小麦 -II- Abstract Weeds with for compete and cropsmoisture，nourishment are hostsof or disease the where disease place survivesinthe winter．which influencesthe and of is output for quality modernized crops．It indispe