上海海洋大学显微技术复习资料.doc

一、填充题： 光学显微镜的分辨率约为 0.2-0.4 毫微米，最高放大率为1500倍左右。电子显微镜的分辨率约为 几个埃，放大率在几百万倍左右。 人眼只能感受光谱中很窄的可见光波长约为 400—700毫微米范围内的电磁波。 数值孔径（NA）又称“镜口率”、“开口率”，简写NA或A。是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断其性能高低的重要标志。 相差显微镜是应用光衍射和干涉原理，把可见光的光程差变成振幅差，使人眼能够分辨。 相衬物镜用于相衬镜检术的专用物镜，其特点是在物镜的后焦点平面处装有相板。 透镜所形成的象除了象的位置、大小、倒正、虚实之外还有成象的质量问题，也就是说，物体通过透镜后所形成的象与理想象在形状、颜色上有着一定的差异，这种差异称为象差。。 特种（专用）显微镜包括7种类型：1、暗场，2、荧光，3、倒置，4、相衬，5、偏光，6、干涉，7、体视。 荧光现象有二种，一种为自发荧光直接经紫外线照射后就能发生的荧光；另一种为激发荧光必须经荧光素处理后再经紫外线照射才能发生荧光。 照明系统有透射式及落射式照明，采用柯勒照明法是为了获得均匀的照明效果，这种照明的热焦点不在被捡物体的平面处，即使长时间的照明，也不致损伤被捡物体。是成功进行显微照相必须的一种照明法。 电子束实际上是一种阴极射线，是带负电荷的粒子，它和其它的光线一样，具有双重性:一种具有波动性，另一种具有粒子性。 透射电子显微镜为了获得高分辨率和高质量的像，要求电子枪和所有的透镜以及光栏等所有光学部件的轴都要精密重合，即在同一轴线上，其操作主要完成合轴操作 ，消像散及聚焦这三大步骤。 扫描电镜的分辨率主要取决于电子束的直径，所以要尽可能缩小它。电子与样品的相互作用会产生多种的信息，基本上分成两大类：一是电子，二是射线，其中二次电子、背散射电子、俄歇电子等信息与扫描电镜的成像有关。 目前有许多种型号的超薄切片机，但主要包括两类：一类是热胀式，另一类是机械式。 固定液的按照成分划分可分为单固定、双固定和多重固定，双固定效果好，应用广泛，即先用1％-3％的戊二醛／缓冲液在室温或4℃下进行前固定，一般单细胞可固定10-30分钟，后用1％饿酸／缓冲液在4℃下固定10-60分钟。 最常用的磷酸钠缓冲液主要由A液磷酸钠氢二钠和B液磷酸钠二氢钠这二种工作液调配成PH值在7.0-7.4之间混合液，但根据样品的需要，也可以调到6.8以下或7.6以上。 脱水剂包括：乙二醇、乙醇、聚乙二醇、甲醇、丙酮、环氧丙烷等，最常用的脱水剂是乙醇和丙酮。 二次电子在扫描电镜成像过程中担任主角。它是样品本身的原子中的外层电子，被入射电子激发出来后，形成带有样品的形貌和成分等信息的电子束，主要反映样品浅表层（约5-50nm）的信息。 在制备扫描电镜生物样品时常采用镀膜方法，一种是金属镀膜法，另一种真空喷镀镀膜法。 德国物理学家Busch早在1926年即已指出“具有轴对称性的磁场对电子束说来起着透镜的作用”。他从理论上奠定了可利用磁场作为电子透镜的基础。 镀膜有如下作用：（1）更好地再现样品表面的形态（2）提高二次电子的溢出提高图象质量3）可以防止样品受传导和对流引起的热损伤，防止样品受金属氧化引起的污染。 普通超薄切片术指不需要特殊的冷冻条件的常规包埋切片技术。其过程一般与光学显微镜的石蜡切片过程原则上基本相似，它也包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片、染色等几个环节。 一般厚度在10-100毫微米的切片称为超薄切片，可分为普通超薄切片术和冷冻超薄切片术两大类。 负染色技术又称阴性反差染色，是将颗粒或者纤维样品分散在具有亲水性支持膜的载网上，然后滴加磷钨酸或醋酸双氧铀等染料，并随即吸去多余染液，样品干燥后残余染料将沉积在样品的周围以及样品的凹陷、缝隙处，而样品本身呈浅色，所以称为负染。 制备扫描电镜的样品的干燥方法有 1、临界点干燥，2、冷冻干燥，3、空气干燥（自然干燥），4、化学药品干燥。 临界点干燥中有很多物质可用做干燥剂，如 一氧化二氮、氟里昻13 、液体二氧化碳 、干冰等等，而常用的干燥剂是液体二氧化碳。 支持膜有多种，较常用的有：孚尔瓦膜、碳膜、火棉胶膜等 什么是分辨率：又称“鉴别率”、“解象力”和“分辨本领”.是指将邻近两点清晰区分辨认的能力。是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。 分辨本领公式：德国著名理论光学家Abbe早在100多年前就给出分辨本领：R=0.61λ/nSinα，n为物体所处媒介的折射率；α为孔径角；λ为发射光波长。 二次电子：二次电子的发射是由于入射电子碰撞样品的核外电子，核外电子获得能量脱离原子而成为二次电子。二次电子所形成的像（二次电子像）反映了样品表面的形貌。它在扫描电镜成像过程中担任主角。它是样品本身的原子中的外层电子，被入射电子激发出来后，形成带有样品的形貌和成