以潮霉素B抗性基因为选择标记水稻立枯丝核菌遗传转化体系构建.docVIP

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以潮霉素B抗性基因为选择标记水稻立枯丝核菌遗传转化体系构建

以潮霉素B抗性基因为选择标记水稻立枯丝核菌遗传转化体系构建摘要:使用含裂解酶(来自Trichoderma harzianum)10mg/ml的0.8M NaCl(Ph5.8),28℃下,处理水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝8小时,获得其原生质体。采用PEG介导的方法,将含有潮霉素B抗性标记的质粒pSM565转入水稻立枯丝核菌的原生质体,并在潮霉素B浓度为30μg/ml的选择性培养基上筛选转化子,获得了5-6个转化子/μg DNA的转化频率。随机挑选8个转化子,通过PCR方法检测到其中存在潮霉素抗性基因。 关键词:水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani);原生质体转化;pSM565 中图分类号:Q37 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-09-0046-2 由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的水稻纹枯病是世界性水稻三大病害之一[1]。立枯丝核菌的致病机理相当复杂,其致病能力是毒素,细胞壁降解酶和菌丝的机械压力这些因子共同作用的结果[2,5]。至于以哪种因子为主,以及各因子间如何相互协调作用还有待于进一步研究。本文构建了针对水稻立枯丝核菌的原生质体遗传转化体系,为从分子水平上研究该菌,进而揭示其致病机理奠定了坚实的基础。 1 材料与方法 1.1 菌株与培养基 水稻立枯丝核菌菌株Rh9由扬州农业大学分离保存。大肠杆菌E.coli DH10B用于载体分子的扩增和转化子中潮霉素B抗性基因的克隆。液体PDA培养基用于水稻立枯丝核菌菌丝的培养。固体PDA培养基用于水稻立枯丝核菌原生质体的再生和转化子的继代培养。液体TB3培养基用于原生质体的复苏。选择培养基(含30μg/ml 潮霉素和0.015%(W/V)琼脂的液体TB3培养基)用于转化子的筛选。 1.2 质粒DNA 用于转化的质粒载体pSM565(GenBank登录号为AY142483)由福建农林大学功能基因组学实验室保存。它带有潮霉素B磷酸转移酶基因(Hyg)和氨苄青霉素抗性基因(Amp)。 1.3 主要试剂 裂解酶(来自Trichoderma harzianum)购自Sigma公司。PEG3350购自Seebio Biotechnology公司。山梨糖醇(Sorbitol)购自Bio Lab公司。限制性内切酶购自New England Biolab(NEB)公司。 1.4 水稻立枯丝核菌原生质体的分离 裂解液:10%(W/V)裂解酶;0.8 mol/L NaCl(pH5.8)。SuTC溶液:20%(W/V)蔗糖,50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),50mmol/L 无水CaCl2,抽滤灭菌。 挑取已生长4-6天的水稻立枯丝核菌Rh9菌丝块,捣碎后放入100ml液体PDA(包含50μg/ml amp)中,28℃下振荡培养2-3天。将培养好的菌丝用孔径为60μm的尼龙膜过滤后,再用0.8mol/L Nacl(pH5.8)冲洗1-2遍。将菌丝刮出,用镊子撕碎,放入约25ml裂解液中,28℃,80r/min,裂解8h。悬浮有原生质体的裂解液用灭过菌的尼龙膜过滤,再用0.8mol/L Nacl冲洗尼龙膜两次。将滤液于4℃,4500r/min,离心6min以收集原生质体,用1ml SuTC重悬原生质体,保存于-80℃。 1.5 水稻立枯丝核菌原生质体的转化 40%PEG3350溶液:含40%(W/V)PEG3350的SuTC溶液。 用SuTC将原生质体稀释至1×106个/ml。取200μl与1μg pSM565载体(图1)DNA混匀,室温下静置20min。加入1.25ml 40%PEG 3350混匀,室温下静置20min。加入5ml TB3液体培养基混匀,室温,80r/min振荡复苏过夜。离心收集原生质体,加入200μl SuTC,轻轻吸打至沉淀完全溶解。将溶液加入冷却至45-55℃的固体TB3(含30μg/ml hygromycin,50μg/ml Amp)中,混匀后,倒入培养皿中。28℃黑暗倒置培养5-6天。 1.6 转化子的PCR鉴定和测序验证 提取转化子的基因组DNA作为模板。根据pSM565中潮霉素抗性基因的5和3端序列设计一对特异引物,上游引物5-GTGCTTTCAGCTTCGATG-3’,下游引物5-AACCAAGCTCTGATAGAG-3’,以PCR法对转化子进行验证。反应条件为:95℃ 3分钟;95℃ 30秒,53℃ 30秒,72℃ 40秒,30个循环,72℃ 7分钟。PCR验证后,切胶回收目的条带,克隆后直接进行测序验证。 2 结果与分析 2.1 水稻立枯丝核

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