以潮霉素B抗性基因为选择标记水稻立枯丝核菌遗传转化体系构建.docVIP

以潮霉素B抗性基因为选择标记水稻立枯丝核菌遗传转化体系构建摘要：使用含裂解酶(来自Trichoderma harzianum)10mg/ml的0.8M NaCl（Ph5.8），28℃下，处理水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝8小时，获得其原生质体。采用PEG介导的方法，将含有潮霉素B抗性标记的质粒pSM565转入水稻立枯丝核菌的原生质体，并在潮霉素B浓度为30μg/ml的选择性培养基上筛选转化子，获得了5-6个转化子/μg DNA的转化频率。随机挑选8个转化子，通过PCR方法检测到其中存在潮霉素抗性基因。 关键词：水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；原生质体转化；pSM565 中图分类号：Q37 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-09-0046-2 由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的水稻纹枯病是世界性水稻三大病害之一[1]。立枯丝核菌的致病机理相当复杂，其致病能力是毒素，细胞壁降解酶和菌丝的机械压力这些因子共同作用的结果[2，5]。至于以哪种因子为主，以及各因子间如何相互协调作用还有待于进一步研究。本文构建了针对水稻立枯丝核菌的原生质体遗传转化体系，为从分子水平上研究该菌，进而揭示其致病机理奠定了坚实的基础。 1 材料与方法 1.1 菌株与培养基 水稻立枯丝核菌菌株Rh9由扬州农业大学分离保存。大肠杆菌E.coli DH10B用于载体分子的扩增和转化子中潮霉素B抗性基因的克隆。液体PDA培养基用于水稻立枯丝核菌菌丝的培养。固体PDA培养基用于水稻立枯丝核菌原生质体的再生和转化子的继代培养。液体TB3培养基用于原生质体的复苏。选择培养基（含30μg/ml 潮霉素和0.015%（W/V）琼脂的液体TB3培养基）用于转化子的筛选。 1.2 质粒DNA 用于转化的质粒载体pSM565（GenBank登录号为AY142483）由福建农林大学功能基因组学实验室保存。它带有潮霉素B磷酸转移酶基因（Hyg）和氨苄青霉素抗性基因（Amp）。 1.3 主要试剂 裂解酶(来自Trichoderma harzianum)购自Sigma公司。PEG3350购自Seebio Biotechnology公司。山梨糖醇（Sorbitol）购自Bio Lab公司。限制性内切酶购自New England Biolab（NEB）公司。 1.4 水稻立枯丝核菌原生质体的分离 裂解液：10%（W/V）裂解酶；0.8 mol/L NaCl（pH5.8）。SuTC溶液：20%（W/V）蔗糖，50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，50mmol/L 无水CaCl2，抽滤灭菌。 挑取已生长4-6天的水稻立枯丝核菌Rh9菌丝块，捣碎后放入100ml液体PDA（包含50μg/ml amp）中，28℃下振荡培养2-3天。将培养好的菌丝用孔径为60μm的尼龙膜过滤后，再用0.8mol/L Nacl（pH5.8）冲洗1-2遍。将菌丝刮出，用镊子撕碎，放入约25ml裂解液中，28℃，80r/min，裂解8h。悬浮有原生质体的裂解液用灭过菌的尼龙膜过滤，再用0.8mol/L Nacl冲洗尼龙膜两次。将滤液于4℃，4500r/min，离心6min以收集原生质体，用1ml SuTC重悬原生质体，保存于-80℃。 1.5 水稻立枯丝核菌原生质体的转化 40%PEG3350溶液：含40%（W/V）PEG3350的SuTC溶液。 用SuTC将原生质体稀释至1×106个/ml。取200μl与1μg pSM565载体（图1）DNA混匀，室温下静置20min。加入1.25ml 40%PEG 3350混匀，室温下静置20min。加入5ml TB3液体培养基混匀，室温，80r/min振荡复苏过夜。离心收集原生质体，加入200μl SuTC，轻轻吸打至沉淀完全溶解。将溶液加入冷却至45-55℃的固体TB3（含30μg/ml hygromycin，50μg/ml Amp）中，混匀后，倒入培养皿中。28℃黑暗倒置培养5-6天。 1.6 转化子的PCR鉴定和测序验证 提取转化子的基因组DNA作为模板。根据pSM565中潮霉素抗性基因的5和3端序列设计一对特异引物，上游引物5-GTGCTTTCAGCTTCGATG-3’，下游引物5-AACCAAGCTCTGATAGAG-3’，以PCR法对转化子进行验证。反应条件为：95℃ 3分钟；95℃ 30秒，53℃ 30秒，72℃ 40秒，30个循环，72℃ 7分钟。PCR验证后，切胶回收目的条带，克隆后直接进行测序验证。 2 结果与分析 2.1 水稻立枯丝核