壳聚糖-明胶-磷酸三钙多孔复合体作为骨组织工程支架的实验分析.pdfVIP

壳聚糖一明胶一磷酸三钙多孔复合体作为 骨组织工程支架的实验研究 摘 要 目的：应用组织工程学技术初步构建有活性的组织工程骨，探索壳聚糖一明 胶一磷酸三钙多孔复合支架作为骨组织工程支架材料的可行性。 方法： l、支架材料的制各 采用相分离法与二次冻干技术，制备孔隙率80％， p 1-t 孔径200m一400rn壳聚糖一明胶一磷酸三钙海绵状复合体。 2、骨髓基质细胞培养组织化学检测取3月龄新西兰兔，骨髓基质细 胞，用含10％胎牛清DMEM液培养原代培养，传代后换诱导液培养，最终分 化为骨髓基质成骨细胞。并对其行碱性磷酸酶染色及钙结节染色鉴定。 3、支架的细胞相容性检测 按MTT法检测支架对骨髓基质细胞增殖 的影响。按对硝基苯磷酸二钠的碱性磷酸酶检测法，检测支架对细胞碱性 磷酸酶活性的影响。取培养6天的细胞一支架复合物的标本，扫描电镜观察 细胞在支架内的生长情况。 4、支架材料的体内降解及生物相容性的观察 3月龄新西兰兔6只， W、 于不同部位皮下植入5ram×5ram×5mm大小的4块标本，分别与4w、8W、12 16W取出植入物。进行大体肉眼与组织学检查，观察植入物在体内的降解情 况及组织的反应性。 5、观察及兔颅骨极限骨缺损的修复实验 取细胞供体薪西兰兔12只， 随机分为两组，制备直径为15mm的颅骨全层圆形骨缺损。实验组与颅骨缺 损处植入直径15mm，厚3mm的圆盘状的细胞一支架复合体，对照组植入同样 大小形态单纯支架，分别4w、8w取材，观察骨形成情况。 结果： 1、骨髓基质细胞的增殖能力与成骨能力骨髓基质细胞于接种24小 时始贴壁，细胞增殖迅速，3-5天细胞形成几个大的细胞集落。诱导后无接 触抑制，呈编织样生长。诱导后的细胞ALP染色阳性率高，重叠长生，有 明显的黑色钙结节形成。提示，本实验中培养的MSCs增殖能力强，经传代 lI 诱导后可分化为骨髓基质成骨细胞。 2、支架的细胞相容性检测结果MTT法检测结果为，随时间的延长， 各组细胞数量都有所增加，实验组与对照组比较均为PO．05差异均无显著 性。ALP活性测定结果为，随时间的延长与细胞数量的增多，各组细胞碱性 磷酸酶活性都有所增加。实验组与对照组差异均无显著性。扫描电镜观察 见细胞支架内生长状态良好，形态饱满，细胞匍匐于支架内的孔隙表面， 可见细胞分泌基质。表明细胞可以在支架上良好生长，支架对细胞的增殖 与碱性磷酸酶活性均无影响，支架的细胞相容性较好。 3、支架材料的体内降解及生物相容性的观察结果植入后4w，有成片 支架材料未吸收，其周有淋巴细胞与多核巨细胞。8w时，仅有少量支架材 料碎片未吸收，淋巴细胞，多核巨细胞进一步减少。t2W时炎细胞消失， 支架材料基本吸收。体内植入未见全身或局部毒性反应、不致溶血、仅有 轻微的，一过性的炎症反应、可被吸收。 4、颅骨极限缺损修复的结果X线摄片观察为大片状X线阻射影像， 随时间延长阻射密度和面积均增大；大体观察硬组织充填骨缺损区，时间 延长后硬度增加：镜下见新骨形成明显，且逐渐趋于成熟。MSO复合支架人 工骨植入骨缺损区后，具有良好的骨修复效果，明显优于对照组。 结论： 壳聚糖一明胶一磷酸三钙海绵状复合体支架材料具有细胞相容性好，生 物相容性好，可降解吸收，有骨传导性，壳聚糖一明胶一磷酸三钙海绵状复 合体是一种具有潜在价值的骨组织工程的支架材料。 关键词： 组织工程，支架材料，骨髓基质细胞，壳聚糖，明胶，磷酸三钙 III on ExperimentalChitosan—Gelatin／B—TCP Study as Composite Bone Tissue