基因重组酿酒酵母PSMA疫苗构建的初步分析.pdfVIP

摘 要 恭困重组酿酒酵母疫茁是一j}孛新型豹“免疫裁激复合物疫莛”，冀既能{乍 为表达体系完成抗原的加载，又能发挥出佐剂作用诱导机体产生有效的抗原特 异淫懿缀照毒羧T漤憨缓藏(cytotoxic lymphocyte，CTL)兔疫疲答。本礤究拟 应用具有高度前列腺肿瘤特异性的前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSi)俸兔黯载貌瓣，逶：；建基函熏缀技术暮并究分辑入PSMA 基因片段在酿淄酵母INVScl中的诱导波达情况，并获得足够数量的基因重组 PSMA酿酒酵母，籍诧{乍为疫苗为进一步探讨其在体内拂的抗前粥腺胂瘸效应及 评估瘤菌的安全性打下基础。 1．材料 双剡性内键酶8ailIH{、XhoI和T4DNA逐援酶赡囊NEB：DNA片段胶回收 试剂懿购自Qiagen；酿酒酵母穿梭诱鼯表达质粒pYES2／NT、酿酒酵母菌株 Kit transformation INVScl发酵母感受态稍蚤移转讫试剂鑫S。e。EasycompTM m)购自 购自Invitrogen；酵蹲培养基、半乳糖、PSMF、玻璃珠(0．4～0．6m cDNA全序列的黧组质粒 表位单克隆抗体购自Invitrogen：含肖PSMA 余试翔笼Sigma或Invitrogen产品。 2．方法 2。1 pYES2／Nf一珞凇攫缀酿潘酵母诱浮表达震粒黪稳建； 用BamHI及XhoI两种限制性内切酶对质粒pcDNA3．0-PSMA进行双酶切， cDNA cDNA片段，并将PSMA 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，闻收2．2Kb的hPSMA 片段甄克隆到酿酒酵母穿梭诱导表达蕨粒pYES2／NT中相应的多克隆经点，连 接产物经酶切鉴定。 2。2羧涯酵避豹pYES2／NT—PS6aA痰歉转纯及骝牲转化子麓筛选： 按Invitrogen 子。 2．3 pYES2／NT-PSMA在酿酒酵母中的诱导表遮及Western印迹分拆： 王 (1)重组pYES2／NT—PSMA的诱导表达： 将阳性克隆单菌落扩增后接种于含2％半乳糖的Sc—Lira培养液，分别于诱 导表达O、4、9、14、19 h后收集酵母菌，酵母沉淀进行玻璃珠破碎抽提蛋白。 (2)表达产物的Western印迹分析： PAGE电泳后，电转 取以上各时间点的样品(蛋白总量为40ug)进行SDS 3．结果： 3．1pYES2／NT—PSMA重组酿酒酵母诱导表达质粒的构建： BamH I和Xho I酶切鉴定重组质粒pYES2／NT—PSMA，酶切结果显示PSMA cDNA片段(2．2Kb)己克隆入酿酒酵母诱导表达质粒pYES2／NT。 3．2酿酒酵母的pYES2／NT—PSMA质粒转化及阳性转化子的筛选： 感受态酿酒酵母菌转化重组质粒后，经尿嘧啶筛选出阳性转化子，平均每 个培养板可获得200’500个阳性转化子。 析： 种rhPSMA，且在半乳糖诱导表达约9小时后达到表达高峰。 4．结论： PSMA基因片段能够在酿酒酵母中诱导表达并完成翻译后糖基化修饰，这 为进一步探讨基因重组酿酒酵母PSMA疫苗在体内外的抗前列腺肿瘤效应及评 估瘤苗的安全性打下了良好的基础。