包埋脱水法超低温保存海带雌、雄配子体的分析.pdfVIP

包埋脱水法超低温保存海带雌、雄配子体的研宄 摘要： ofLamin∞ia hresch) 本文以海带日长雌、雄配子体(gametophytes japonica 为试验材料，用包埋脱水法进行超低温冰冻保存。将海带雌、雄配子体分别打碎成小段 后包埋在3噼目藻酸钙胶球中，经过蔗糖预培养一段时间，再片j硅胶吸湿法脱水席，进行 保存。探讨了蔗糖浓度和预培养时间、脱水速率、胶球含水量对超低温保存存活率的影 响；保存后配子体的发育晴况，结果表明： 1．蔗糖浓度和预培养时间对海带雌、雄配子体超低温保存存活率的影响 蔗糖预培养对雌、雄配子体冰冻前后存活率的影响较人。雌、雄配子体的最佳预培 养条件不同，雌配子体荏蔗糖浓度0．4mol／L预培养9h，存活率达45．9{6；雄配子体在蔗 糖浓度0．3mol／]预培养9h，存活率达29．7％。 2．脱水速率对海带雌、雄配子体超低温保存存活率的影响 包埋后，分别以不同脱水速率(1％、5％、896、lo％、12％、15％、2096含水量／h)脱水， 结果雌、雄配子体都在1嘴含水量／h的脱水速率获得最高存活率，分别为49．8％和34．6％。 3．胶球含水量对海带雌、雄配子体超低温保存存活率的影响 胶球含水量对脱水过程的存活率影响不大，但对冰冻保存的存活率影响很大。雌、 雄配子体的最佳含水量都是4096，冰冻后存活率分别为49．6％和34．2％。 4．超低温冰冻保存前后海带配子体发育情况 镜检观察，经过超低温保存后的海带配子体，在与冰冻保存前的材料相同的条件F 培养，可以发育成幼孢子体，形态与保存前的对照没有差别。 荚键词：海带雌、雄配子体包埋脱水法超低温冰冻保存蔗糖预培养 脱水速率含水量存活率发育 包埋脱水法超低温保存海带雌．雄配子体的研究 前 言： 近50年来，由于超低温(通常指液氮低温，--196C)保存技术的建立和发展，已有 多种植物的细胞、组织和器官实现了超低温冰冻保存。在超低温条件下，儿乎所有的细 胞代谢活动、生长过程等都停止了，因而，既避免了在传统的动、植物组织和细胞培养 过程中可能发生的染色体、基因组和基因水平上的变异，又保存了细胞的活力科l形态发 生的潜能…。到80年代末．进行超低温保存成功的植物材料已达百余种”。在藻类方面 成功保存培养物的资料也很多。其中Hwang等从1969年保存22种细胞藻类达6～8年之 久”】。陈国宜、阙求登在液氮中成功保存坛紫菜果孢子和海萝的四分孢子，并提出超低 温保存法建立海藻孢子库的设想”J。超低温保存不仅可以克服藻类常规继代培养中的费 时、费力、释易污染等弊病，而且能够实现种质长期保存的目的。由于藻类具有丰富的、 多样性的基闵资源以及它们在生物技术上的潜力与日俱增，藻类种质超低温保存的研究 近年来日益受到重视。 长期以来，藻类超低温保存的方法一般为两步法，80年代末90年代初新发展了玻 璃化和包埋脱水法。 两步法：将预处理后的细胞在程序降温仪的监控F缓慢的冷却至一定的预冻温度， 然后陕速冷冻。目前使用该法已成功保存多种藻类，但对一些结构复杂的、较大的顽拗 型藻类的保存成功率低”1。而且这种方法容易使细胞或组织在缓慢的降温过程中遭受冷 冻损伤，其主耍原因在于：(1)缓慢降温时，细胞内外冰晶的形成和生长造成细胞质膜 等生物膜的挤压和撕裂，从而产生机械损伤；(2)冻存液的渗透陛与pH值的变化较大， 容易引起细胞的渗透性损伤；(3)细胞脱水的溶质浓度升高造成蛋白质和酶活性降低…’。 玻璃化法：所谓“玻璃化”就是将细胞或组织置于由一定比咧的渗透性与非渗透性 保护剂组成的玻璃化溶液中，使细胞及其玻璃化溶液在足够快的降温速率F过冷到玻璃 化转变温度，而被固化成玻璃态(或jF晶态)，并以这种玻璃态在低温下保存…’。运用这 种方法可以使细胞内外避免结晶生成，从而俐氐对细胞的各种损伤，但是玻璃化溶液对 细胞具有一定的毒性．复温后其残余会造成再培养过程中一部分细胞死亡。 包埋(胶囊化)脱水法：将细胞悬液与褐藻酸钠混合，在氯化钙溶液中固定成胶球， _}{j无菌空气流或硅胶等干燥脱水到一定程度，放入液氨中。应用包埋脱水法冰冻保存生 物体的组织、器官是近几年发展起来的一项前沿低温生物学技术方法。该方法于90年代 初建立，操作简单，不需要复杂设备，而且不使用抗冻保护剂，无疑是对超低温保存技 术的一个重大改进”’。