凝血酶对大鼠脑微血管内皮细胞凋亡作用的分析.pdfVIP

凝瓶酶对大鼠脑微血管内皮细胞凋亡作用的研究 摘要 目的：本实验通过研究凝血酶对体外培养的原代大鼠脑微血管内皮细 胞(B¨EC)的毒性作用及加用凝血酶特异性抑制剂重组水蛭素后的细胞形 态及其生化特征、遗传物质性状的变化，来证实凝血酶对大鼠脑微血管内 皮细胞存在凋亡作用。同时观察胞内游离钙离子浓度的变化来探讨内皮细 胞凋亡的分子机制。而探讨凝血酶的预适应现象进一步揭示凝血酶在血脑 屏障损伤中的地位和作用。方法：取新生大鼠脑组织，剥离硬脑膜，经过 匀浆、过滤分离脑微血管段，0．1％IV型胶原酶消化后进行原代培养。7～lOd 后待有多量内皮细胞从贴壁的微血管段中长出，用含20％胎牛血清的M199 培养基培养，以后每2～3d换液一次。经形态学及常规因子Ⅷ相关抗原免 疫细胞化学方法鉴定为脑微血管内皮细胞后，传代培养并进行实验。取第 3代细胞，以1×104／cm2的细胞密度种于预先放有细胞爬片的24孔培养板， 每组4孔。实验分为对照组、不同剂量凝血酶组、凝血酶+水蛭素组、预 适应组。对照组在培养孔中加入含10％胎牛血清的M199培养基。不同剂 凝血酶于BMVEC培养基中，并使胎牛血清终浓度为lO％，孵育12小时后， 小时后检测。通过测定脑微血管内皮细胞在体外对不同剂量凝血酶及凝血 酶特异性抑制剂水蛭素处理的反应，同时观察预适应处理时的反应，来研 ， 究凝血酶对脑微血管内皮细胞的毒性作用。实验中使用倒置相差显微镜观 察细胞形态变化；使用透射电子显微镜观察细胞超微结构变化；使用细胞 免疫组织化学结合分子生物学方法(原位末端脱氧核甘酸转移酶介导dUTP 缺口末端标记)来研究细胞遗传物质DNA对凝血酶毒性的反应；并用1．5％ 琼脂糖凝胶电泳技术研究细胞内DNA断裂等分子生物学行为的改变。使用 荧光标记技术结合流式细胞仪来观察细胞内钙离子浓度的变化，即用钙离 来探讨凝血酶毒性作用的分子机制。结果：(1)培养的脑微血管段于7～ 10天后长出多量梭形细胞，胞核居中，成“铺路石”样外观。经Ⅷ因子相 关抗原免疫组化分析和细胞形态分析，鉴定为脑微血管内皮细胞。经传代 培养后，细胞形态无明显变化。(2)用倒置相差显微镜在形态学上证实， 低剂量凝血酶可以促使脑微血管内皮细胞收缩，而高剂量凝血酶处理后， 脑微血管内皮细胞数量减少，形态不规则，呈现明显的凋亡相。使用透射 电镜技术观察到BMVEC胞浆浓缩，染色质在核周边凝集，可见核碎裂、空 泡和凋亡小体形成等超微结构的细胞凋亡形态学改变从薅证实了凋亡细胞 的存在。用原位末端脱氧核甘酸转移酶介导dUTP缺口末端标记(TUNEL) 凝血酶组相比，P0．01，差异有显著性。用1．5％琼脂糖凝胶电泳也证明， +水蛭素组梯状条带不明显。(3)细胞内钙离子浓度随时间不同有明显动 ’ 态变化，且凝血酶特异性抑制剂水蛭素可以完全阻断凝血酶的这种作用。 钙离子荧光探针(Fura2／AM)负载后，使用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓 组脑微血管内皮细胞内钙离子浓度在静息时与单纯凝血酶组(300U／m1)比 式细胞仪检测表明，预适应组脑微血管内皮细胞内钙离子浓度在12、18、 结论：(1)小剂量凝血酶促使脑微血管内皮细胞收缩，而大剂量凝血酶促 使脑微血管内皮细胞凋亡，导致血脑屏障的损伤。(2)凝血酶特异性抑制 剂水蛭素可以完全阻断BMVEC钙离子的增加。而细胞内钙离子浓度正常化 后，BMVEC的凋亡明显减少，说明细胞内钙离子至少部分地参与了凝血酶 的促凋亡作用。(3)小剂量凝血酶对BMVEC有预适应现象。综合以上结果， 可以看出，凝血酶参与了BMVEC凋亡过程，加重血脑屏障的破坏，进而引 起脑水肿的发生。早期应用其特异性抑制剂水蛭素，可减轻BMVEC凋亡， 保护血脑屏障。重组水蛭素治疗有可能成为防治脑血管疾病的有效措施之 ， 一。凝血酶的预适应现象可为临床进行脑保护治疗寻找新的途径。 关键词：脑微血管内皮细胞；细胞培养；凝血酶；凋亡；水蛭素 ofRatBrainMicrovascularEndothelial Apoptosis CellsInduced