Calpain3的初步提取和对其自动降解性的研究.pdfVIP

Calpain3 的初步提取和对其自动降解性的研究 ∗ 童敏，徐幸莲 ，周光宏 （南京农业大学 农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室，江苏 南京 210095） 摘 要：Calpain3 是一种骨骼肌特异性的钙激活酶，而且其基因突变会导致四肢肌肉营养 不良症 2A型(LGMD2A)的发生。由于Calpain3 具有很强的自动降解性，对其的提取纯化和依 钙性的研究很难进行。在本实验中，Calpain3 在Ca2+存在的条件下，发生了不同程度的自 动降解，说明Calpain3 能够与Ca2+发生一定的作用。并且，研究还指出了，Calpian3 的自 动降解分为三个连续性的过程：首先降解为 89 KDa 和 58 KDa的中间片断，然后进一步降 解为 55KDa的片断并保持不变。其降解的速度与Ca2+浓度和反应时间成正比。 关键词：钙激活酶 3 ；自动降解 ；钙离子 前言 [1] 骨骼肌特异性 的Calpain3 （又称Ncl- 1、p94 、CAPN3 ）是除μ-Calpain和m- Calpain 以外，另一个可能与肉类嫩化有关的Calpains成员,由于含有 3 个额外序列，分子量 比的大亚基大。由于Calpain3 在体外迅速的自动降解阻碍了在蛋白质水平上对其进行研 究。Calpain3 的半寿期约为20 分钟，并且典型的钙激活酶抑制剂如：Calpastatin 、E-64 、 亮肽素对Calpain3 的自动降解都没有抑制的作用[2] 。对于Calpain3 和钙离子之间的作用，目 前还存在争议。 本实验从牛肉背最长肌中提取到了具有一定活性的Calpain3 粗酶液，通过蛋白质免疫 印迹法，对Calpain3 的随时间的降解降解变化进行了研究，并对不同Ca2＋浓度下Calpain3 自动降解的变化进行了比较系统的探讨，为对Calpain3 的性质及其在成熟过程中的作用的 研究奠定的一定基础。 1.材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 仪器 85-2 控温磁力搅拌器，金坛市恒丰仪器厂；WH-2 微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂； 雪皇牌冰柜；海尔牌冷藏柜；101A-3 型电热鼓风干燥箱，上海实验仪器厂；722S 可见分光 光度计，上海精密仪器有限公司；HH-42 快速恒温数显水箱，常州国华电器有限公司；TY- 80S 脱色摇床，南京大学；pH211 Microprocessor pH Meter, HANNA instruments; ULTRA-TURRAX T25 basci, IKA-WERKE;BS224S 电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公 司； Mini PROTEAN 3 cell 电泳槽，BIO-RAD;TRANS-BLOT SD SEMI-DRT TRANSFER cell, BIO-RAD ; Power Pac 1000, BIO-RAD. 1.1.2 试剂 Calpain3 的一抗﹑TMB 显色液和彩色 Marker 为 SIGMA 公司所购；辣根过氧化物酶标记 的羊抗兔 IgG 为 CALBIOCHEM 公司所购； PVDF膜为 Pall 公司所购；本实验其他试剂均为 国产分析纯。 1.2 试验方法 1.2.1 肉样采集与处理 黄牛经宰杀放血后，立即将右侧背最长肌取下（第 10 胸椎到第 4 胸椎），放入液氮中 冷冻后于－80℃冰箱中保存。 1.2.2 蛋白样品的制备 参考Kayko Kinbara,[3]等的方法并加以改进。剪取 4g经修整后的牛肉样品，加入 50ml 预冷的提取缓冲液（50 mmol ·L-1NaCl, 1 mmol ·L-1 NaHCO ,5 mmol ·L-1EDTA, 5 3 作者简介：童敏（1981—），女，硕士研究生，研究方向为肉品质量与控制，E-mail ： tongmin81@ 基金项目：教育部博士点基金（20020307006 ） ∗ 通讯作者Corresponding author 。