密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建.docVIP

　　密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建 【摘要】 目的: 构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1L1IRESL2。方法: 用PCR技术从988载体中获得L1IRESL2片段, 将该片段克隆到pCRXLTOPO载体, 然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中, 从而构建真核共表达载体pcDNA3.1L1IRESL2; 通过水动力转染技术(hydrodynamicsbased transfection)和脂质体细胞转染法(liposomemediated transfection of cells), 检测衣壳基因的体内、 外转录情况; 重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化, 用artin Mueller惠赠）, pcDNA3.1(+)载体（本实验室库存）; 细胞株: 293T细胞（中国农业科学院哈尔滨兽研所惠赠）; LA Taq DNA聚合酶和反转录试剂盒（购自fermentas公司）; 质粒提取和胶回收试剂盒（购自AXYGEN公司）; TOPOXL PCR克隆试剂盒及LipofecamineTM2000（购自Invitrogen公司）; 电转化感受态Top10菌（购自TaKaRa公司）; HPV16 L1单克隆抗体(mAb)（购自上海吉泰新择生物科技有限公司）; 辣根过氧化物(HRP)标记的羊抗鼠IgG（购自北京博奥森生物技术有限公司）; 其他试剂均为国产分析纯; 昆明白雌性小鼠（6～8周龄, 质量18～22 g）购自新疆医科大学动物实验中心。 　　1.2 方法 　　1.2.1 引物设计 根据pcDNA3.1(+)载体和德国科学家Martin Mueller提供的密码子优化的HPV16 L1、 L2基因序列设计5条引物, 具体序列见表1。 　　表1 引物设计（略） 　　Tab 1 Primer design 　　1.2.2 密码子优化的pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒的构建 构建策略: 以988质粒为模板扩增L1IRESL2基因片段, 将该片段构建到pCRXLTOPO载体上, 然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中。目的基因的获取: 以988质粒为模板, 以HPVHL1L2P1/HPVHL1L2P2为引物, 在LA DNA聚合酶作用下, 94℃预变性5 min, 94℃变性45 s, 67℃退火45 s, 68℃延伸4.5 min, 共30个循环, 68℃延伸30 min, 合成L1IRESL2基因。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。pCRXLTOPOL1IRESL2的构建: 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 切胶回收并纯化L1IRESL2片段。按照TOPOXL PCR克隆试剂盒说明书, 构建pCRXLTOPOL1IRESL2。电泳检测EcoR I、 Xho I 和Sfi I酶切产物。pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒的构建与鉴定: 用EcoR I、 Xho I和Sfi I酶切pCRXLTOPOL1IRESL2质粒, 回收纯化L1IRESL2片段。T4 DNA连接酶连接L1IRESL2基因片段与双酶切后的pcDNA3.1载体, 16℃过夜。用电转化法转化感受态Top10菌株（电压2500 V, 电阻200 Ω, 电容25 μF）, 37℃摇床孵育1 h后涂布含氨苄青霉素的LB选择平板, 37℃过夜。次日随机挑取阳性菌落, 碱裂解法小量提取质粒。EcoR I及Xho I双酶切, 琼脂糖电泳鉴定正确后送往上海生工测序。 　　1.2.3 小鼠肝脏中pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒表达情况的检测 将等量的空pCDNA3.1载体和pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒（均为10 μg）分别溶于2.5 mL灭菌生理盐水中。采用以流体力学为基础的大容量快速尾静脉注射法（hydrodynamicsbased transfection method, HD)在7 s内注入小鼠尾静脉中［9, 10］。每组2只小鼠, 注射后8 h处死, 取肝脏, 按照Invitrogen trizol说明书提取总RNA, 按照fermentas公司反转录试剂盒要求合成cDNA。利用L1基因、 L2基因特异性引物检测这两种基因在小鼠肝脏中的表达情况。 　　1.2.4 293T细胞 中pcDNA3.1L1IRESL2重组质粒表达情况的检测 选取对数生长期的293T细胞进行转染实验,转染步骤按Invitrogen公司提供的293T转染细胞的实验流程操作。空pCDNA3.1载体作为对照组, pcDNA3.1L1IRE