家族性肌萎缩侧索硬化症研究中pGBKT7.docVIP

　　家族性肌萎缩侧索硬化症研究中pGBKT7 【摘要】 目的 构建能在酵母菌AH109中表达的mSOD1cDNA的穿梭表达质粒pGBKT7-mSOD1cDNA,研究突变SOD1编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用。方法 通过PCR法以真核表达载pEGFP-mSOD1cDNA为模板，扩增获得了120bp的mSOD1基因的末端及DNA结合域的片段，经过SalⅠ、EcoRⅠ双酶切后，基因重组的方法定向亚克隆于酵母双杂交载体pGBKT7中，构建形成pGBKT7-mSOD1真核表达载体。结果 经转化，提取质粒双酶切，核苷酸测序，BALST比对鉴定表明构建成功。结论 成功构建穿梭质粒pGBKT7-mSOD1cDNA，为深入研究突变的SOD1基因编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用奠定了基础。 【关键词】 酵母双杂交 载体 亚克隆 mSOD1cDNA pGBKT7 　　Abstract: Objective To Construct of pGBKT7mSOD1 Yeast Tilial amyotrophic lateral sclerosis and to study Proteinprotein interactions of mutation SOD1 encode protein. Methods n-SOD、Fe-SOD，哺乳类动物体内，仅含有Cu,Zn-SOD与Mn-SOD。分布在胞浆中Cu,Zn-SOD，称为SOD1；分布于线粒体中Mn-SOD，称为SOD2；分布于胞外Cu,Zn-SOD称为SOD3,其中SOD1是细胞中高水平表达的SOD，是SOD的主要形式［1］。研究小组在对一个肌萎缩侧索硬化症家系致病基因的研究中发现［2］，SOD1第二号外显子出现突变，测序分析证实第2号外显子编码区插入了一个碱基A，第2外显子的插入突变导致SOD1转录和翻译时阅读框改变，结果SOD1翻译提前终止，研究小组把这108个碱基对的cDNA暂命名为mSOD1cDNA,提交GenBank，获得的编号是EF143990。本文报告载体pGBKT7-mSOD1cDNA构建，为研究mSOD1基因突变编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用奠定了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 主要试剂：限制性内切酶SalⅠ、EcoRⅠ、Taq聚合酶购自大连Takara公司。DNA连接试剂盒购自美国MBI公司，卡那霉素购自上海华美公司，质粒抽提试剂盒购自美国Promega公司。 　　1.1.2 菌株和质粒：pGBKT7购自美国BD Clontech公司，pEGFP-mSOD1为本课题组提供，大肠杆菌DH5α为烧伤研究所提供。根据mSOD1cDNA的序列设计引物：pGBKT7-mSOD1-EcoRIsense5-gacGAATTCATGGCGACGAAG-3,pGBKT7-mSOD1-SalIantisense:5-gacGTCGACATGCTTCCC CACACCTTCATCT-3，引物由上海生工生物科技有限公司合成。 　　1.1.3 仪器设备：台式离心机(上海安亭科仪厂生产)，PCR仪(美国Bio-Rad公司生产)，电泳仪(美国Bio-Rad公司生产)，手提紫外灯(美国Upland公司生产)，凝胶成像仪系统Gel Doc2000(美国Bio-Rad公司生产) 　　1.2 方法 　　1.2.1 PCR反应：以pEGFP-mSOD1cDNA为模板，无核酸酶去离子水36.5μL，10×PCR　buffer (mg2+ free)5μL,dNTP(2.5mM)4 μL,Mgcl2(25mM)3 μL,上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL,模板1μL,Taq酶(5u/μL)0.5μL,总反应体系50μL。扩增条件：94℃预变性5min，紧跟30个循环，每一个循环94℃变性30s,55℃复性30s，72℃延伸30s,最后72℃延伸10min补齐末端。 　　1.2.2 PCR产物电泳及低熔点琼脂糖凝胶回收和纯化：取PCR反应物5 μL经0.8%琼脂糖凝胶电泳，结果扩增出一条约120bp的片段。取余下的PCR产物45 μL行1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化120bp的mSOD1cDNA片段，再次5 μL经0.8%琼脂糖凝胶电泳，并测序。 　　1.2.3 mSOD1酵母双杂交表达载体pGBKT7-mSOD1cDNA构建：分别以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切pGBKT7和mSOD1回收纯化酶切片段及线性化载体，在T4DNA连接酶的作用下连接，连接产物转化感受态细胞Ecoli.DH5α,将pGBKT7-mSOD1cDNA转化的细胞接种于卡那霉素选择培养基上，37℃培养12～16h，挑出阳性菌落摇菌，采用小质粒提取试剂盒提取质粒，以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定。