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* * * 提高抗体亲和力 简 介 Synopsis 西北师范大学生命科学学院 2009级生物技术1班 zcx 亲和力成熟：在体内初次反应产生的抗体亲和力较低，在随后的抗原的刺激下，抗体可变区基因发生体细胞突变，造成亲和力的改变，亲和力提高的变种具有选择优势，最后形成产生高亲和力抗体的B克隆细胞。 在体外可以模拟体内亲和力成熟过程，提高抗体亲和力。其要点是：①对初次选择得到的地亲和力抗体克隆进行可变区基因高突变，产生高亲和力变种；②对高亲和力克隆的优势选择。 提高抗体亲和力 框 架 Scheme 突变的策略：PCR错配；利用致突变株大肠杆菌在细胞内进行突变；人工合成寡核苷酸；链替换 高亲和力克隆的选择：利用抗原—抗体结合解离的动力学规律；利用解离速度选择；改变洗脱条件 提高抗体亲和力 西北师范大学生命科学学院 2009级生物技术1班 zcx 内 容 Content 突变策略 体内二次反应时抗体可变区可以发生局部高频突变，在体外一 般用一下方法： 1、PCR错配（不定向突变）； 2、利用致突变株大肠杆菌在细胞内进行突变（不定向突变） 一些大肠杆菌由于遗传上的缺陷而具有较高的亲和力。举例：mutD5菌株，由于DNA复制中的错配修复功能的缺陷和聚合酶Ⅲ缺乏3’→5‘外切酶活性，导致突变率较正常菌株高1000倍以上。 提高抗体亲和力 西北师范大学生命科学学院 2009级生物技术1班 zcx 突变策略 3、人工合成寡核苷酸（定向突变） 内 容 Content 提高抗体亲和力 西北师范大学生命科学学院 2009级生物技术1班 zcx 用人工合成寡核苷酸的方法，在与抗原结合的关键部位有目的地引入突变可以提高突变效率这些突变通常局限于CDR区。其有两种类型： ①在选定的位置上完全随机，每个位置4个碱基出现的几率相等。 ②通过改进DNA合成的程序，是合成的寡核苷酸在欲导入突变的区段内含有一定比例的突变。 突变策略 4、链替换 内 容 Content 以亲本抗体的一条链（如轻链）与另一条链（如重链）的文库组合，构建抗体库，筛选亲和力增高的克隆，在固定其重链，用同样的方法选择具有更高亲和力的轻链。 提高抗体亲和力 西北师范大学生命科学学院 2009级生物技术1班 zcx 1、利用抗原—抗体结合解离的动力学规律 内 容 Content 高亲和力克隆的选择 使用生物素化的抗原在液相体系中进行筛选，通过限制生物素化抗原的浓度来区分不同亲和力的抗体。 用生物素化的抗原在液相体系中进行筛选，通过限制生物素化抗原的浓度区分不同亲和力抗体。 提高抗体亲和力 西北师范大学生命科学学院 2009级生物技术1班 zcx 内 容 Content 高亲和力克隆的选择 2、利用解离速度选择 抗原抗体结合是一个动态平衡过程，亲和高的抗体具有具有较慢的解离速率，在生物素化抗原的筛选体系中，当抗原抗原体系达到平衡后，将反应体系稀释扩大。加入过量非生物素化游离抗原，可以捕捉解离的亲和力较低的抗体，由此增加高亲和力抗体的选择。 提高抗体亲和力 西北师范大学生命科学学院 2009级生物技术1班 zcx 提高抗体亲和力 内 容 Content 高亲和力克隆的选择 3、改变洗脱条件 为了筛选得到高亲和力的抗体，可以提高洗脱液的洗脱能力，如降低PH值。举例：不同浓度的硫氰酸盐具有不同能力的洗脱能力，被用于测定抗体的相对亲和力。在噬菌体抗体筛选中，用不同浓度的硫氰酸盐溶液在抗体库筛选中作为洗脱液，这样可以洗脱不同亲和力的抗体，由此可以选择出高亲和力抗体。 西北师范大学生命科学学院 2009级生物技术1班 zcx * * * * *