蛙脑膜炎败血金黄杆菌病检疫技术规程.doc

蛙脑膜炎败血金黄杆菌病检疫技术规程 1　范围 本标准规定了蛙脑膜炎败血金黄杆菌病(Chryseobacterium Meningosepticum of Frog,Rana spp）检疫的试剂和培养基、设备和器械、检疫方法及无害化处理。 本标准适用于我省蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的检疫。 2　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789　食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 SC/T 7014　水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103　水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7105　染疫水生动物无害化处理规程 3　试剂和培养基 试剂和培养基的配制按GB/T 4789、SC／T 7014和SC/T 7103的规定执行。 4　设备和器械 设备和器械按SC／T 7014和SC/T 7103的规定执行。 5 检疫方法 5.1　流行病学调查 本病的病原菌为脑膜炎败血伊丽莎白菌（Elizabethkingia meningosepticum），原名为蛙脑膜炎败血金黄杆菌（Chryseobacterium meningosepticum）。该菌主要感染牛蛙、美国青蛙、虎纹蛙等蛙类，亲蛙、成蛙、幼蛙和蝌蚪均可发病，其中蝌蚪、幼蛙的死亡率较高。 全国各养殖地区均有本病发生。5月至10月为我省主要发病季节。在室内恒温养殖条件下，发病季节不明显。接触染菌水体是该病的重要感染途径。 5.2　临诊检查 病蛙主要表现运动机能失调和白内障。 发病初期，病蛙腹部膨胀，在水面向一侧作间歇性或连续性旋转游动。随着病程发展，头部歪斜，在水面不停地旋转游动。伏在岸上的病蛙身体明显歪向一侧，遇人工刺激向一侧转圈。多数病蛙眼部出现白内障，严重时双目失明。 5.3　病理学检查 5.3.1　解剖可见病蛙肝脏淤血、肿大，肾肿大、充血, 肠、膀胱充血，脾脏萎缩, 脂肪层变薄, 脊椎两侧腹腔壁有出血点和淤斑。 5.3.2　病蛙病理学变化主要为局部皮肤出现坏死性炎症，局灶性急性化脓性肌炎和肺炎，轻度卡他性胃肠炎，局部肝坏死，肾脏局部有化脓性炎症。 白内障病蛙脑内的视盖组织细胞大量坏死, 视神经纤维变性。 5.3.3　蝌蚪的后肢及腹部有出血点和血斑。 符合本标准5.1流行病学调查内容和本标准5.2及5.3 检查结果的病蛙可诊断为疑似蛙脑膜炎败血金黄杆菌病，确诊是否患蛙脑膜炎败血金黄杆菌病应进行病原菌的分离与鉴定。 5.4　病原菌的分离与鉴定 脑膜炎败血伊丽莎白菌属于黄杆菌纲（Flavobacteria）黄杆菌目（Flavobacteriales）黄杆菌科（Flavobacteriaceae）伊丽莎白菌属（Elizabethkingia）。 5.4.1　采样与样品处理 按SC/T 7103和SC/T 7014的规定执行。 5.4.2　细菌的分离纯化 从病蛙取少许肝、肾、眼、脑组织按常规法划线接种胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）或营养琼脂平板，28℃培养（24～48）h。从中挑取不透明、圆形、微隆起、表面光滑、边缘整齐、淡黄色的单个优势菌落在同样的琼脂平板上再次划线分离纯化。 5.4.3　分离菌的鉴定 5.4.3.1　分离菌的革兰染色及形态特征观察 从纯化的分离菌培养物上挑取少许单菌落涂片，按GB/T 4789和SC/T 7014的规定分别进行革兰染色和鞭毛染色，在油镜下可见无特殊构造的革兰阴性杆菌。 5.4.3.2　分离菌的生理生化试验 脑膜炎败血伊丽莎白菌生理生化特性按GB/T 4789和SC/T 7014的规定检测。脑膜炎败血伊丽莎白菌生理生化特性检测参见附录A。 5.4.3.3　分离菌检测结果判定 5.4.3.3.1　分离菌的染色及形态观察结果判定：脑膜炎败血伊丽莎白菌为非发酵型革兰阴性需氧杆菌，菌体细长、末端略圆、大小为（0.4～0.5）μm×（0.8～1.0）μm，单个分散排列，无鞭毛，无芽孢，无荚膜。 5.4.3.3.2　分离菌的生化特性结果判定：参见附录A。 5.4.3.3.3　分离菌染色及形态检查如符合5.4.3.3特性结果，生理生化特性符合附录A结果，则分离菌鉴定为脑膜炎败血伊丽莎白菌。 5.5　检疫结果判定 疑似蛙脑膜炎败血金黄杆菌病的病蛙，其病原菌检测结果符合本标准5.4.3.3，可确诊为蛙脑膜炎败血金黄杆菌病。 6　无害化处理 按SC/T 7105 的规定执行。 附录项目 结果 项目 结果 50C 或420C生长 - 麦康凯平板上生长 + 运动力 - 硫化氢产生 - 靛基质（产吲哚） + β溶血 - 枸橼酸盐利用 - 硝酸盐还原 - 氧化酶 + β-半乳糖苷酶（ONPG） +