RNA萃取-华联生物科技.PDF

RNA萃取 實驗前必讀! 成功經驗法則大公開! 本期專文要來跟大家討論的話題是核糖核酸 (RNA)的萃取，看到這裡各位心中可能已經起了 疑問: RNA 萃取不是很簡單嗎?只要照著標準步驟 操作，加一加試劑就完成了，有必要大費周章特 地開篇幅來談這件事嗎?其實越簡單的東西遇到困 難時就越難解，各位看倌就請耐著性子，聽我們 娓娓道來。 Lab 的經驗和客戶的難題 圖圖一、電泳分析之一 、電 泳 分析之RRNANA品品質狀態，顯示品質良好質 狀態 ，顯 示品質良 好 以華聯基因體實驗室的長期以來承接客戶RNA 之之總總 RRNA(laneNA (la ne 1 1,, 9 9,, 1 10),0) , 部部分裂解以及嚴重裂分裂解 以及嚴重 裂 檢體的經驗來說，我們經常遇到的問題是 (1)RNA 解解之總之總 RRNA(lane 8NA (la ne 8與與 lane 6 and 7),la ne 6 a nd 7) , 具具有有 DDNANA 污污染之總染之總 RRNANA ( (lanela ne 4 4 a andnd 5 5)) 以以及僅及僅 ggDNAD NA 核核 的總量不夠， (2)RNA有嚴重的鹽類汙染，(3)RNA 酸酸 (lane 2 and 3)(la ne 2 a nd 3) 。。 有嚴重的有機溶劑汙染， (4)DNA汙染(5)樣品降 解嚴重 圖一和圖二( ) 。前四項問題都還好解決，只 需要再次萃取或進行純化即可解決，但是樣品降 解就較為棘手，常常因重新準備檢體一來一往， 耗掉不少心力和時間，最後也拿不到好的結果。 客戶經常會問為什麼執行晶片實驗會如此要求 RNA品質呢 ? 而其他的檢測方法如即時定量聚合連 鎖反應(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, Q-PCR)卻不需要 ? 回答這個問題前就要從實驗的原理說起，簡單 的講 Q-PCR的檢測原理是針對要檢測的基因，設 計一對基因特異性的引子，透過反轉錄反應 (RT)配 圖圖二、吸光值圖譜分析，二 、吸 光值圖譜 分析 ，002B2 B檢檢體在體在 223030及及 22808 0 分分 合 PCR的放大方式和及時偵測放大的產物量，藉 別別有高的吸光值，顯示分別有鹽類有高的吸 光值 ，顯 示分別 有鹽類 ((OD230)O D 2 30)及及有有 以回推原始的RNA含量；而 RT的方式主要是採用 機機溶劑溶 劑((OD280)O D2 80) 汙汙染。染 。 隨機引子 (Random_ primer) 、進行互補DNA 1 2013.04 (cDNA)的翻製，因此即便 RNA有些微裂解，作為 作步驟為例，來跟讀者分享 RNA萃取步驟中應注 模板的 RNA也可以忠實的被翻製成 cDNA 。但是 意事項及改善萃取 RNA值與量的方法。 晶片實驗進行，主要是以放大和訊息 RNA(mRNA)完全配對的互補RNA(cRNA) ，再進 器具如何清潔？ 行雜合反應，此步驟必須利用 poly(dT)- T7啟動子 RNA 萃取過程中，會面臨的最大的敵人就是 序列和訊息RNA的 poly(A)結合後，將T7啟動子序 RNase ，RNase是一個非常頑強的 RNA分解酶， 列連帶的鑲入反轉錄的cDNA的 5端，再經由T7啟 它幾乎無所不在，在我們所處的環境中、身體表 動子驅動試管內反轉錄反應，生合成反股的 cRNA 面甚至細胞內就有內源性的 RNase存在。 RNase ，再進行後續的晶片雜交的實驗。可想而知，如