聚焦色谱1-1.pptxVIP

聚焦色谱 Chromatofocusing;;等 电聚焦电泳;根据蛋白等电点的不同而将它们分离。; 聚焦色谱(chromatofocusing)是Sluyterman等在等电点聚焦电泳方法的基础上发展起来的。这一方法既有聚焦作用的性能，又有浓缩样品和分辨力高等优点。整个操作过程不需要特殊实验设备，因此它是一种纯化制备蛋白质、核酸的好方法。 ;第一节 基本原理;一、介质（多缓冲交换剂）;PBE94，PBE118 ;二、聚焦层析缓冲液;2.样品缓冲液 样品缓冲液原则上与起始缓冲液相同或相似，主要用于溶解或稀释待测样品。如果分离的样品是固体，用样品缓冲液按一定的浓度直接溶解；如果是溶液，可以用样品缓冲液稀释或透析平衡;3.洗脱缓冲液 聚焦层析的缓冲液也称多缓冲剂，是一种两性电解质缓冲液，其性质与载体两性电解质相似，由分子量不等、多种组分的多羧基多氨基脂肪族同系物组成 多羧基多氨基脂肪族同系物在250nm有较大吸收，而在280nm吸收很低。在聚焦洗脱过程中最好选择280nm检测有效成分的出峰情况，否则干扰较大;，用0.1M NaOH对2ml 的Polybuffer进行滴定的滴定曲线; GE公司出售的多缓冲剂有polybuffer96和polybuffer74两种。 这两种多缓冲剂分别在pH6～9和4~7范围内具有较强的缓冲能力；如将它们混合在一起，则较强缓冲能力的pH范围为4 ～ 9。;三、聚焦层析原理;1.pH梯度的形成;例：当柱中装有阴离子交换聚焦介质PBE 94时，首先用乙醇胺-HCl（ pH =9.4）的起始缓冲液平衡，直至流出液的pH相同时，柱内就会自动形成一个连续的pH梯度，然后选用洗脱缓冲液洗脱，并将该缓冲液的终止pH最低设定为pH6。这样就获得一个pH9~6的pH梯度的色谱聚焦的洗脱条件;2．蛋白质的行为 ; 3．聚焦效应 蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件。 如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。 从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到pHpI时被洗出(见图8-4)。 在前蛋白质样品被洗出前，再加入第二份同种蛋白质样品时， 后者将在洗脱液的作用下快速向前移动，而不被固定相吸附，直到其迁移至近似本身等电点的环境处(即前样品的缓慢迁移处)。 然后两份样品以同样的速度迁移，最后同时从柱底洗出。 ;;第二节 操作;1、多缓冲剂的选择;2、多缓冲交换剂用量的选择;3、多缓冲交换剂的处理;将一定量的多缓冲交换剂悬于起始缓冲液中（1∶1），脱气 垂直放置层析柱，除去底端尼龙网下的气泡，关闭下端出口 在柱中放2~3ml起始缓冲液，加入多缓冲交换剂悬液 打开柱子底部开关，待多缓冲交换剂慢慢沉降 安装柱顶部接头，并排尽管道中的气泡 用10~15倍床体积的起始缓冲液平衡柱子，直至底部流出液的pH、电导系数和起始缓冲液相同 检查柱子质量：用牛细胞色素C通过柱子，牛细胞色素C成红色， PI=10.5，应能迅速穿过柱体流走;4、样品液的制备;5、上样与洗脱;6、样品中多缓冲剂的去除; 纯化制备蛋白质、核酸； 鉴定酶的性质； 测定蛋白质的等电点。;样品: 部分纯化后的血红蛋白 分离柱: Mono P 0.5 cm × 20 cm 起始缓冲液: 0.025 M triethanolamine-methanesulfonic acid, pH 8.1 流速: 1 ml/min (305 cm/h) 洗脱缓冲液: Polybuffer 96-methanesulfonic acid, diluted in distilled water 1:16, pH 6.65;样品: Iron-saturated diferric transferrin 分离柱: Mono P 0.5 cm × 20 cm 起始缓冲液: 0.025 M bis-Tris HCl, pH 6.45, 10% betaine hydrate, 3 mM FeCl3 流速: 1 ml/min (305 cm/h) 洗脱缓冲液: Polybuffer 74 diluted 1:10 in distilled water, pH 5, 10% betaine hydrate, 3 mM FeCl3;疏水色谱hydrophobic interaction chromatography ; 疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析，从作用机制来看，它属于吸附层析。“疏水作用”一词是Kauzmann于195